Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Termofilele sunt microorganisme care se dezvoltă la temperaturi ridicate. Studierea acestora poate oferi informații valoroase despre modul în care viața se adaptează la condiții extreme. Cu toate acestea, este dificil să se obțină condiții de temperatură ridicată cu microscoapele optice convenționale. Au fost propuse mai multe soluții de casă bazate pe încălzirea electrică rezistivă locală, dar nu există o soluție comercială simplă. În această lucrare, introducem conceptul de încălzire cu laser la microscală în câmpul vizual al microscopului pentru a oferi temperaturi ridicate pentru studiile termofile, menținând în același timp mediul utilizatorului blând. Încălzirea la microscală la intensitate moderată a laserului poate fi realizată folosind un substrat acoperit cu nanoparticule de aur ca absorbant de lumină biocompatibil și eficient. Sunt discutate posibilele efecte ale convecției fluidului la microscală, retenției celulelor și mișcării termoforetice centrifuge. Metoda a fost demonstrată la două specii: (i) Geobacillus stearothermophilus, o bacterie termofilă activă care se reproduce la aproximativ 65°C, despre care am observat că germinează, crește și înoată sub încălzire la microscală; (ii) Thiobacillus sp., o arhee optim hipertermofilă. la 80°C. Această lucrare deschide calea pentru observarea simplă și sigură a microorganismelor termofile folosind instrumente de microscopie moderne și accesibile.
De-a lungul a miliarde de ani, viața de pe Pământ a evoluat pentru a se adapta la o gamă largă de condiții de mediu care sunt uneori considerate extreme din perspectiva noastră umană. În special, unele microorganisme termofile (bacterii, arhee, ciuperci) numite termofile se dezvoltă în intervalul de temperatură de la 45°C la 122°C1, 2, 3, 4. Termofilele trăiesc în diverse ecosisteme, cum ar fi gurile hidrotermale de adâncime, izvoarele termale. sau zone vulcanice. Cercetările lor au generat mult interes în ultimele decenii din cel puțin două motive. În primul rând, putem învăța de la ei, de exemplu, cum termofilele 5, 6, enzimele 7, 8 și membranele 9 sunt stabile la temperaturi atât de ridicate sau cum termofilele pot rezista la niveluri extreme de radiație10. În al doilea rând, ele stau la baza multor aplicații biotehnologice importante1,11,12, cum ar fi producția de combustibil13,14,15,16, sinteza chimică (dihidro, alcooli, metan, aminoacizi etc.)17, biominerea18 și biocatalizatori termostabili7,11, 13. În special, reacția în lanț a polimerazei (PCR)19, cunoscută în prezent, implică o enzimă (polimeraza Taq) izolată din bacteria termofilă Thermus aquaticus, una dintre primele termofile care au fost descoperite.
Cu toate acestea, studiul termofilelor nu este o sarcină ușoară și nu poate fi improvizat în niciun laborator biologic. În special, termofilii vii nu pot fi observați in vitro cu niciun microscop cu lumină standard, chiar și cu camere de încălzire disponibile comercial, de obicei evaluate pentru temperaturi de până la 40°C. Din anii 1990, doar câteva grupuri de cercetare s-au dedicat introducerii sistemelor de microscopie la temperatură înaltă (HTM). În 1994 Glukh și colab. Camera de încălzire/răcire a fost concepută pe baza utilizării unei celule Peltier care controlează temperatura capilarelor dreptunghiulare închise pentru a menține anaerobicitatea 20 . Dispozitivul poate fi încălzit până la 100 °C cu o viteză de 2 °C/s, permițând autorilor să studieze motilitatea bacteriei hipertermofile Thermotoga maritima21. În 1999 Horn și colab. A fost dezvoltat un dispozitiv foarte asemănător, încă bazat pe utilizarea capilarelor încălzite potrivite pentru microscopia comercială pentru a studia diviziunea/conexiunea celulară. După o perioadă lungă de relativă inactivitate, căutarea HTM-urilor eficiente a fost reluată în 2012, în special în legătură cu o serie de lucrări ale grupului Wirth care au folosit un dispozitiv inventat de Horn et al. În urmă cu cincisprezece ani, motilitatea unui număr mare de arhee, inclusiv hipertermofile, a fost studiată la temperaturi de până la 100°C folosind capilare încălzite23,24. Ei au modificat, de asemenea, microscopul original pentru a obține o încălzire mai rapidă (câteva minute în loc de 35 de minute pentru a atinge temperatura setată) și pentru a obține un gradient de temperatură liniar de peste 2 cm pe mediu. Acest dispozitiv de modelare a gradientului de temperatură (TGFD) a fost utilizat pentru a studia mobilitatea multor termofile în cadrul gradienților de temperatură la distanțe relevante din punct de vedere biologic 24, 25.
Încălzirea capilarelor închise nu este singura modalitate de a observa termofilii vii. În 2012, Kuwabara et al. S-au folosit camere Pyrex de unică folosință de casă, sigilate cu adeziv rezistent la căldură (Super X2; Cemedine, Japonia). Probele au fost plasate pe o placă de încălzire transparentă disponibilă în comerț (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japonia) capabilă să se încălzească până la 110°C, dar nu a fost destinată inițial pentru bioimaging. Autorii au observat divizarea eficientă a bacteriilor termofile anaerobe (Thermosipho globiformans, timp de dublare 24 min) la 65°C. În 2020, Pulshen și colab. Încălzirea eficientă a vaselor metalice comerciale (AttofluorTM, Thermofisher) a fost demonstrată folosind două elemente de încălzire de casă: un capac și o etapă (configurație inspirată de mașina PCR). Această asociere are ca rezultat o temperatură uniformă a lichidului și previne evaporarea și condensul în partea inferioară a capacului. Utilizarea unui inel O evită schimbul de gaze cu mediul. Acest HTM, numit Sulfoscope, a fost folosit pentru a vizualiza Sulfolobus acidocaldarius la 75°C27.
O limitare recunoscută a tuturor acestor sisteme a fost restricționarea utilizării obiectivelor cu aer, orice imersie în ulei fiind nepotrivită pentru o astfel de temperatură ridicată și pentru imagini prin probe transparente > 1 mm grosime. O limitare recunoscută a tuturor acestor sisteme a fost restricționarea utilizării obiectivelor cu aer, orice imersie în ulei fiind nepotrivită pentru o astfel de temperatură ridicată și pentru imagini prin probe transparente > 1 mm grosime. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование возование воЈозокво, пожение ьку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и зало подходило зрачные образцы толщиной > 1 мм. Un neajuns recunoscut al tuturor acestor sisteme a fost limitarea utilizării obiectivelor cu aer, deoarece orice imersie în ulei nu era potrivită pentru o temperatură atât de ridicată și pentru vizualizare prin probe transparente > 1 mm grosime.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适吘都不适吘翙适合濙适合气物镜，任何油浸都不适合制是限制使用空气物镜，毫米厚的透明样品成像。 O limitare recunoscută a tuturor acestor sisteme este limitarea utilizării unei oglinzi cu aer antrenat, deoarece orice imersie în ulei este nepotrivită pentru imagistica probelor transparente > 1 mm grosime la temperaturi atât de ridicate. Общепризнанныы недостаuter к всех этих систеprezeм является оран dejaAT ружение ваасло неctor cord для таких ысоких тии чераuterз и ыизализации чераuterз прозрачныалзазцы т тrez п este Un dezavantaj recunoscut al tuturor acestor sisteme este utilizarea limitată a lentilelor de aer, orice imersie în ulei este nepotrivită pentru astfel de temperaturi ridicate și vizualizare prin probe transparente > 1 mm grosime.Mai recent, această limitare a fost ridicată de Charles-Orzag și colab. 28, care a dezvoltat un dispozitiv care nu mai furnizează căldură în jurul sistemului de interes, ci mai degrabă în interiorul sticlei de acoperire în sine, acoperit cu un strat subțire transparent al unui rezistor din ITO (oxid de indiu-staniu). Capacul poate fi încălzit până la 75 °C prin trecerea unui curent electric prin stratul transparent. Totuși, autorul trebuie să încălzească obiectivul și până la obiectiv, dar nu mai mult de 65 °C, pentru a nu-l deteriora.
Aceste lucrări arată că dezvoltarea microscopiei optice eficiente la temperatură înaltă nu a fost adoptată pe scară largă, necesită adesea echipamente de casă și este adesea realizată cu prețul rezoluției spațiale, ceea ce reprezintă un dezavantaj serios, având în vedere că microorganismele termofile nu sunt mai mari decât câteva. micrometre. Volumul redus de încălzire este cheia pentru rezolvarea a trei probleme inerente ale HTM: rezoluție spațială slabă, inerție termică ridicată atunci când sistemul se încălzește și încălzirea dăunătoare a elementelor înconjurătoare (ulei de imersie, lentilă obiectiv... sau mâinile utilizatorului) la temperaturi extreme. ).
În această lucrare, introducem un HTM pentru observarea termofililor care nu se bazează pe încălzirea rezistivă. În schimb, am realizat încălzirea localizată într-o regiune limitată a câmpului vizual al microscopului prin iradierea cu laser a unui substrat care absoarbe lumina. Distribuția temperaturii a fost vizualizată utilizând microscopie de fază cantitativă (QPM). Eficacitatea acestei metode este demonstrată de Geobacillus stearothermophilus, o bacterie termofilă mobilă care se reproduce la aproximativ 65°C și are un timp scurt de dublare (aproximativ 20 de minute), și Sulfolobus shibatae, un hipertermofil care crește optim la 80°C (arhaea) pentru a ilustra. Rata normală de replicare și înotul au fost observate în funcție de temperatură. Acest laser HTM (LA-HTM) nu este limitat de grosimea lamei sau de natura obiectivului (imersie în aer sau ulei). Acest lucru permite utilizarea oricărui obiectiv de înaltă rezoluție de pe piață. De asemenea, nu suferă de încălzire lentă din cauza inerției termice (realizează încălzire instantanee la o scară de milisecunde) și folosește doar componente disponibile în comerț. Singurele preocupări noi legate de siguranță sunt legate de prezența fasciculelor laser puternice (de obicei de până la 100 mW) în interiorul dispozitivului și, eventual, prin ochi, care necesită ochelari de protecție.
Principiul LA-HTM este utilizarea unui laser pentru a încălzi local proba în câmpul vizual al microscopului (Fig. 1a). Pentru a face acest lucru, proba trebuie să absoarbă lumina. Pentru a folosi o putere rezonabilă a laserului (mai puțin de 100 mW), nu ne-am bazat pe absorbția luminii de către mediul lichid, ci am crescut artificial absorbția probei prin acoperirea substratului cu nanoparticule de aur (Fig. 1c). Încălzirea nanoparticulelor de aur cu lumină este de o importanță fundamentală în domeniul plasmonicii termice, cu aplicații așteptate în biomedicină, nanochimie sau recoltarea luminii solare29,30,31. În ultimii ani, am folosit acest LA-HTM în mai multe studii legate de aplicațiile cu plasmă termică în fizică, chimie și biologie. Principala dificultate cu această metodă este în afișarea profilului final al temperaturii, deoarece temperatura ridicată este limitată la o regiune la microscală din cadrul probei. Am arătat că maparea temperaturii poate fi realizată cu interferometrul de forfecare transversală cu patru lungimi de undă, o metodă simplă, de înaltă rezoluție și foarte sensibilă de microscopie cantitativă de fază, bazată pe utilizarea rețelelor de difracție bidimensionale (cunoscute și sub numele de rețele încrucișate) 33,34,35,36. Fiabilitatea acestei tehnici de microscopie termică, bazată pe microscopie cu front de undă cu rețele încrucișate (CGM), a fost demonstrată într-o duzină de lucrări publicate în ultimul deceniu37,38,39,40,41,42,43.
Schema de instalare a microscopului laser paralel de încălzire, modelare și temperatură. b Geometria eșantionului constând dintr-o cameră AttofluorTM care conține o lamelă acoperită cu nanoparticule de aur. c Priviți cu atenție eșantionul (nu la scară). d reprezintă profilul uniform al fasciculului laser și (e) distribuția ulterioară simulată a temperaturii pe planul probei nanoparticulelor de aur. f este un profil inelar al fasciculului laser adecvat pentru a genera o temperatură uniformă așa cum se arată în simularea distribuției temperaturii rezultată prezentată în (g). Bară de scară: 30 µm.
În special, am realizat recent încălzirea celulelor de mamifere cu LA-HTM și CGM și am urmărit răspunsurile la șoc termic celular în intervalul 37-42 ° C, demonstrând aplicabilitatea acestei tehnici la imagistica cu o singură celule vii. Cu toate acestea, aplicarea LA-HTM la studiul microorganismelor la temperaturi ridicate nu este clară, deoarece necesită mai multă precauție în comparație cu celulele de mamifere: în primul rând, încălzirea fundului mediului cu zeci de grade (mai degrabă decât câteva grade) conduce la un gradient vertical puternic de temperatură. poate crea o convecție fluidă 44 care, dacă nu este ferm atașată de substrat, poate provoca mișcare și amestecare nedorită a bacteriilor. Această convecție poate fi eliminată prin reducerea grosimii stratului de lichid. În acest scop, în toate experimentele prezentate mai jos, suspensiile bacteriene au fost plasate între două lame de acoperire cu grosimea de aproximativ 15 µm plasate în interiorul unei cupe metalice (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). În principiu, convecția poate fi evitată dacă grosimea lichidului este mai mică decât dimensiunea fasciculului laserului de încălzire. În al doilea rând, lucrul într-o geometrie atât de limitată poate sufoca organismele aerobe (vezi Fig. S2). Această problemă poate fi evitată prin utilizarea unui substrat care este permeabil la oxigen (sau orice alt gaz vital), lăsând bule de aer prinse în interiorul lamei de acoperire sau prin găuri în lamelă superior (vezi Fig. S1) 45 . În acest studiu, am ales cea din urmă soluție (Figurile 1b și S1). În cele din urmă, încălzirea cu laser nu asigură o distribuție uniformă a temperaturii. Chiar și la aceeași intensitate a fasciculului laser (Fig. 1d), distribuția temperaturii nu este uniformă, ci mai degrabă seamănă cu distribuția gaussiană datorită difuziei termice (Fig. 1e). Atunci când scopul este stabilirea unor temperaturi precise în câmpul vizual pentru studierea sistemelor biologice, profilele inegale nu sunt ideale și pot duce, de asemenea, la mișcarea termoforetică a bacteriilor dacă acestea nu aderă la substrat (vezi Fig. S3, S4)39. În acest scop, am folosit un modulator de lumină spațială (SLM) pentru a modela fasciculul laser în infraroșu în funcție de forma inelului (Fig. 1f) în planul probei pentru a obține o distribuție perfect uniformă a temperaturii într-o zonă geometrică dată, în ciuda difuziei termice (Fig. 1d) 39 , 42, 46. Așezați o lamelă superioară peste un vas de metal (Figura 1b) pentru a evita evaporarea mediului și observați timp de cel puțin câteva zile. Deoarece acest lamel superior nu este sigilat, mediu suplimentar poate fi adăugat cu ușurință în orice moment, dacă este necesar.
Pentru a ilustra modul în care funcționează LA-HTM și pentru a demonstra aplicabilitatea sa în cercetarea termofilă, am studiat bacteriile aerobe Geobacillus stearothermophilus, care au o temperatură optimă de creștere de aproximativ 60-65°C. Bacteria are, de asemenea, flageli și capacitatea de a înota, oferind un alt indicator al activității celulare normale.
Probele (Fig. 1b) au fost pre-incubate la 60°C timp de o oră și apoi plasate într-un suport de probă LA-HTM. Această pre-incubare este opțională, dar totuși utilă, din două motive: în primul rând, când laserul este pornit, determină creșterea și divizarea imediată a celulelor (vezi filmul M1 în Materiale suplimentare). Fără pre-incubare, creșterea bacteriilor este de obicei întârziată cu aproximativ 40 de minute de fiecare dată când o nouă zonă de vizualizare este încălzită pe probă. În al doilea rând, pre-incubarea de 1 oră a promovat aderența bacteriilor la lamelă, împiedicând celulele să iasă din câmpul vizual din cauza termoforezei atunci când laserul a fost pornit (vezi filmul M2 în Materiale suplimentare). Termoforeza este mișcarea particulelor sau moleculelor de-a lungul unui gradient de temperatură, de obicei de la cald la rece, iar bacteriile nu fac excepție43,47. Acest efect nedorit este eliminat pe o anumită zonă prin utilizarea SLM pentru a modela fasciculul laser și a obține o distribuție plată a temperaturii.
Pe fig. Figura 2 prezintă distribuția temperaturii măsurată prin CGM obținută prin iradierea unui substrat de sticlă acoperit cu nanoparticule de aur cu un fascicul laser inelar (Fig. 1f). O distribuție plană a temperaturii a fost observată pe întreaga zonă acoperită de fasciculul laser. Această zonă a fost setată la 65°C, temperatura optimă de creștere. În afara acestei regiuni, curba temperaturii scade în mod natural la \(1/r\) (unde \(r\) este coordonata radială).
o Hartă de temperatură a măsurătorilor CGM obținute prin utilizarea unui fascicul laser inelar pentru a iradia un strat de nanoparticule de aur pentru a obține un profil plat de temperatură pe o zonă circulară. b Izoterma hărții de temperatură (a). Conturul fasciculului laser este reprezentat de un cerc punctat gri. Experimentul a fost repetat de două ori (vezi Materiale suplimentare, Figura S4).
Viabilitatea celulelor bacteriene a fost monitorizată timp de câteva ore utilizând LA-HTM. Pe fig. 3 arată intervalul de timp pentru patru imagini luate dintr-un film de 3 ore și 20 de minute (Film M3, Informații suplimentare). S-a observat că bacteriile proliferează activ în zona circulară definită de laser unde temperatura a fost optimă, apropiindu-se de 65°C. În schimb, creșterea celulelor a fost redusă semnificativ când temperatura a scăzut sub 50 ° C timp de 10 secunde.
Imagini optice de profunzime ale bacteriilor G. stearothermophilus care cresc după încălzirea cu laser în momente diferite, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, din 200 Extras dintr-un film de un minut (film M3 furnizat în Informații suplimentare) suprapus pe harta temperaturii corespunzătoare. Laserul se aprinde la momentul \(t=0\). Izoterme au fost adăugate imaginii de intensitate.
Pentru a cuantifica în continuare creșterea celulelor și dependența acesteia de temperatură, am măsurat creșterea biomasei diferitelor colonii de bacterii inițial izolate în câmpul vizual Movie M3 (Fig. 4). Bacteriile părinte selectate la începutul formării unității formatoare de mini colonii (mCFU) sunt prezentate în Figura S6. Măsurătorile masei uscate au fost efectuate cu o cameră CGM 48 care a fost folosită pentru a mapa distribuția temperaturii. Capacitatea CGM de a măsura greutatea uscată și temperatura este puterea LA-HTM. După cum era de așteptat, temperatura ridicată a provocat o creștere mai rapidă a bacteriilor (Fig. 4a). După cum se arată în diagrama semi-log din Fig. 4b, creșterea la toate temperaturile urmează creșterii exponențiale, unde datele utilizează funcția exponențială \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), unde \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – timpul de generare (sau timpul de dublare), \( g =1/ \tau\) – rata de creștere (număr de diviziuni pe unitatea de timp). Pe fig. 4c arată rata de creștere respectivă și timpul de generare în funcție de temperatură. mCFU cu creștere rapidă se caracterizează prin saturarea creșterii după două ore, un comportament așteptat datorită densității bacteriene ridicate (similar cu faza staționară din culturile lichide clasice). Forma generală \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) corespunde curbei în două faze așteptate pentru G. stearothermophilus cu o rată optimă de creștere în jurul valorii de 60-65°C. Potriviți datele folosind un model cardinal (Figura S5)49 unde \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, ceea ce este de acord cu alte valori citate în literatură49. Deși parametrii dependenți de temperatură sunt reproductibili, rata maximă de creștere a \({G}_{0}\) poate varia de la un experiment la altul (a se vedea figurile S7-S9 și filmul M4). Spre deosebire de parametrii de ajustare a temperaturii, care ar trebui să fie universali, rata maximă de creștere depinde de proprietățile mediului (disponibilitatea nutrienților, concentrația de oxigen) în cadrul geometriei la microscale observate.
a Creșterea microbiană la diferite temperaturi. mCFU: Unități formatoare de colonii în miniatură. Date obținute dintr-un videoclip cu o singură bacterie care crește într-un gradient de temperatură (filmul M3). b La fel ca (a), scară semilogaritmică. c Rata de creștere\(\tau\) și timpul de generare\(g\) calculate din regresia liniară (b). Bare de eroare orizontale: intervalul de temperatură în care mCFU s-au extins în câmpul vizual în timpul creșterii. Bare de eroare verticale: eroare standard de regresie liniară.
Pe lângă creșterea normală, unele bacterii au plutit uneori la vedere în timpul încălzirii cu laser, care este un comportament așteptat pentru bacteriile cu flageli. Filmul M5 în informații suplimentare arată astfel de activități de înot. În acest experiment, radiația laser uniformă a fost utilizată pentru a crea un gradient de temperatură, așa cum se arată în figurile 1d, e și S3. Figura 5 prezintă două secvențe de imagini selectate din filmul M5 care arată că o bacterie prezintă mișcare direcțională, în timp ce toate celelalte bacterii rămân nemișcate.
Cele două intervale de timp (a) și (b) arată înotul a două bacterii diferite marcate cu cercuri punctate. Imaginile au fost extrase din filmul M5 (furnizat ca material suplimentar).
În cazul G. stearothermophilus, mișcarea activă a bacteriilor (Fig. 5) a început la câteva secunde după ce fasciculul laser a fost pornit. Această observație subliniază răspunsul temporal al acestui microorganism termofil la o creștere a temperaturii, așa cum a observat deja Mora și colab. 24 . Subiectul motilității bacteriene și chiar al termotaxiei poate fi explorat în continuare folosind LA-HTM.
Înotul microbian nu trebuie confundat cu alte tipuri de mișcare fizică, și anume (i) mișcarea browniană, care pare a fi mișcare haotică fără direcție definită, (ii) convecția 50 și termoforeza 43, constând într-o deplasare regulată de-a lungul unei temperaturi. gradient.
G. stearothermophilus este cunoscut pentru capacitatea sa de a produce spori foarte rezistenți (formarea de spori) atunci când este expus la condiții de mediu nefavorabile ca apărare. Când condițiile de mediu devin din nou favorabile, sporii germinează, formând celule vii și reluând creșterea. Deși acest proces de sporulare/germinare este bine cunoscut, nu a fost niciodată observat în timp real. Folosind LA-HTM, raportăm aici prima observație a evenimentelor de germinare la G. stearothermophilus.
Pe fig. 6a prezintă imagini time-lapse ale adâncimii optice (OT) obținute folosind un set CGM de 13 spori. Pe tot timpul de colectare (15 h 6 min, \(t=0\) – începutul încălzirii laser), 4 din 13 spori au germinat, la momente succesive \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' și \(11\) h \(30\)'. Deși doar unul dintre aceste evenimente este prezentat în Figura 6, 4 evenimente de germinare pot fi observate în filmul M6 în materialul suplimentar. Interesant este că germinarea pare să fie aleatorie: nu toți sporii germinează și nu germinează în același timp, în ciuda acelorași schimbări în condițiile de mediu.
a Time-lapse constând din 8 imagini OT (imersie în ulei, 60x, obiectiv 1,25 NA) și (b) evoluția biomasei agregatelor de G. stearothermophilus. c (b) Desenat pe o scară semi-log pentru a evidenția liniaritatea ratei de creștere (linie întreruptă).
Pe fig. 6b,c arată biomasa populațiilor de celule în câmpul vizual ca o funcție de timp pe întreaga perioadă de colectare a datelor. Decăderea rapidă a masei uscate observată la \(t=5\)h în fig. 6b, c, datorită ieșirii unor celule din câmpul vizual. Rata de creștere a acestor patru evenimente este \(0,77\pm 0,1\) h-1. Această valoare este mai mare decât rata de creștere asociată cu Figura 3. 3 și 4, unde celulele cresc normal. Motivul creșterii ratei de creștere a G. stearothermophilus din spori este neclar, dar aceste măsurători evidențiază interesul LA-HTM și lucrează la nivel de celulă unică (sau la nivel de mCFU unic) pentru a afla mai multe despre dinamica vieții celulare. .
Pentru a demonstra în continuare versatilitatea LA-HTM și performanța sa la temperaturi ridicate, am examinat creșterea Sulfolobus shibatae, o arhee acidofilă hipertermofilă cu o temperatură optimă de creștere de 80°C51. În comparație cu G. stearothermophilus, aceste arhei au și o morfologie foarte diferită, semănând mai degrabă cu sfere de 1 micron (coci) decât cu tije alungite (bacili).
Figura 7a constă din imagini secvențiale de profunzime optică ale mCFU de S. shibatae obținute folosind CGM (a se vedea filmul M7 în Materiale suplimentare). Acest mCFU crește la aproximativ 73 ° C, sub temperatura optimă de 80 ° C, dar în intervalul de temperatură pentru creșterea activă. Am observat mai multe evenimente de fisiune care au făcut ca mCFU să arate ca microstruguri de arheea după câteva ore. Din aceste imagini OT, biomasa mCFU a fost măsurată în timp și prezentată în Figura 7b. Interesant, mCFU-urile S. shibatae au prezentat o creștere liniară mai degrabă decât creșterea exponențială observată cu mCFU-urile G. stearothermophilus. A existat o discuție de lungă durată52 despre natura ratelor de creștere a celulelor: în timp ce unele studii raportează rate de creștere ale microbilor care sunt proporționale cu dimensiunea lor (creștere exponențială), altele arată o rată constantă (creștere liniară sau biliniară). După cum au explicat Tzur și colab.53, distincția între creșterea exponențială și (bi)liniară necesită o precizie de <6% în măsurătorile biomasei, ceea ce este inaccesibil pentru majoritatea tehnicilor QPM, chiar implicând interferometrie. După cum au explicat Tzur și colab.53, distincția între creșterea exponențială și (bi)liniară necesită o precizie de <6% în măsurătorile biomasei, ceea ce este inaccesibil pentru majoritatea tehnicilor QPM, chiar implicând interferometrie. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста третого роста треточ% треточ экспоненциального х биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерфериромерфер. După cum au explicat Zur și colab.53, distincția între creșterea exponențială și (bi)liniară necesită o precizie <6% în măsurătorile biomasei, ceea ce este de neatins pentru majoritatea metodelor QPM, chiar și folosind interferometrie.După cum au explicat Zur și colab. 53, distingerea între creșterea exponențială și (bi)liniară necesită o precizie mai mică de 6% în măsurătorile biomasei, ceea ce este de neatins pentru majoritatea metodelor QPM, chiar și atunci când se utilizează interferometria. CGM realizează această acuratețe cu precizie sub-pg în măsurătorile biomasei36,48.
a Time-lapse constând din 6 imagini OT (imersie în ulei, 60x, obiectiv NA 1.25) și (b) evoluția biomasei micro-CFU măsurată cu CGM. Vedeți filmul M7 pentru mai multe informații.
Creșterea perfect liniară a S. shibatae a fost neașteptată și nu a fost încă raportată. Cu toate acestea, este de așteptat o creștere exponențială, cel puțin pentru că în timp trebuie să apară diviziuni multiple de 2, 4, 8, 16... celule. Am emis ipoteza că creșterea liniară s-ar putea datora inhibării celulelor din cauza împachetarii dense a celulelor, la fel cum creșterea celulelor încetinește și ajunge în cele din urmă la o stare latentă când densitatea celulară este prea mare.
Încheiem prin a discuta pe rând următoarele cinci puncte de interes: reducerea volumului de încălzire, reducerea inerției termice, interesul pentru nanoparticulele de aur, interesul pentru microscopia de fază cantitativă și un posibil interval de temperatură în care poate fi utilizat LA-HTM.
În comparație cu încălzirea rezistivă, încălzirea cu laser utilizată pentru dezvoltarea HTM oferă mai multe avantaje, pe care le ilustrăm în acest studiu. În special, în mediile lichide din câmpul vizual al microscopului, volumul de încălzire este menținut în câteva (10 μm) 3 volume. În acest fel, doar microbii observați sunt activi, în timp ce alte bacterii sunt latente și pot fi folosite pentru a studia în continuare proba - nu este nevoie să schimbați proba de fiecare dată când trebuie verificată o nouă temperatură. În plus, încălzirea la microscală permite examinarea directă a unei game largi de temperaturi: Figura 4c a fost obținută dintr-un film de 3 ore (Filmul M3), care necesită de obicei pregătirea și examinarea mai multor mostre – câte una pentru fiecare dintre probele studiate. y este temperatura reprezentând numărul de zile din experiment. Reducerea volumului încălzit menține, de asemenea, toate componentele optice din jur ale microscopului, în special lentila obiectivului, la temperatura camerei, ceea ce a fost o problemă majoră cu care se confruntă comunitatea până acum. LA-HTM poate fi folosit cu orice obiectiv, inclusiv cu lentile cu imersie în ulei, și va rămâne la temperatura camerei chiar și cu temperaturi extreme în câmpul vizual. Principala limitare a metodei de încălzire cu laser pe care o raportăm în acest studiu este că celulele care nu aderă sau plutesc pot fi departe de câmpul vizual și dificil de studiat. O soluție ar putea fi folosirea lentilelor cu mărire redusă pentru a obține o creștere mai mare a temperaturii de peste câteva sute de microni. Această precauție este însoțită de o scădere a rezoluției spațiale, dar dacă scopul este studierea mișcării microorganismelor, nu este necesară o rezoluție spațială mare.
Scala de timp pentru încălzirea (și răcirea) a sistemului \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) depinde de dimensiunea acestuia, conform legii \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), unde \ (L\ ) este dimensiunea caracteristică a sursei de căldură (diametrul fasciculului laser în studiul nostru este \(L\ aproximativ 100\) μm), \(D\) este difuzivitatea termică a mediului (medie în caz, sticlă și apă Viteza de difuzie\(D\ aproximativ 2\{10}^{-7}\) m2/s Prin urmare, în acest studiu, răspunsuri în timp de ordinul a 50 ms, adică cvasi-instantanee). schimbări de temperatură, pot fi de așteptat. Această stabilire instantanee a creșterii temperaturii nu numai că scurtează durata experimentului, dar permite și sincronizarea precisă \(t=0\) pentru orice studiu dinamic al efectelor temperaturii.
Metoda noastră propusă este aplicabilă oricărui substrat care absoarbe lumină (de exemplu, probe comerciale cu acoperire ITO). Cu toate acestea, nanoparticulele de aur sunt capabile să ofere o absorbție mare în infraroșu și o absorbție scăzută în domeniul vizibil, ale căror caracteristici din urmă sunt de interes pentru observarea optică eficientă în domeniul vizibil, în special atunci când se utilizează fluorescența. În plus, aurul este biocompatibil, inert din punct de vedere chimic, densitatea optică poate fi ajustată de la 530 nm la infraroșu apropiat, iar pregătirea probelor este simplă și economică29.
Microscopia cu front de undă cu rețea transversală (CGM) permite nu numai cartografierea temperaturii la microscală, ci și monitorizarea biomasei, făcând-o deosebit de utilă (dacă nu este necesar) în combinație cu LA-HTM. În ultimul deceniu, s-au dezvoltat și alte tehnici de microscopie a temperaturii, în special în domeniul bioimaginii, iar cele mai multe dintre ele necesită utilizarea de sonde fluorescente sensibile la temperatură54,55. Cu toate acestea, aceste metode au fost criticate și unele rapoarte au măsurat schimbări nerealiste de temperatură în interiorul celulelor, posibil datorită faptului că fluorescența depinde de mulți factori, alții decât temperatura. În plus, majoritatea sondelor fluorescente sunt instabile la temperaturi ridicate. Prin urmare, QPM și în special CGM reprezintă o tehnică ideală de microscopie a temperaturii pentru studierea vieții la temperaturi ridicate folosind microscopia optică.
Studiile S. shibatae, care trăiesc optim la 80°C, arată că LA-HTM poate fi aplicat pentru a studia hipertermofilele, nu doar termofilele simple. În principiu, nu există o limită a intervalului de temperaturi care poate fi atins folosind LA-HTM și chiar și temperaturi de peste 100°C pot fi atinse la presiunea atmosferică fără fierbere, așa cum a demonstrat grupul nostru de 38 în aplicații de chimie hidrotermală la atmosferă. presiunea A. Un laser este utilizat pentru încălzirea nanoparticulelor de aur 40 în același mod. Astfel, LA-HTM are potențialul de a fi utilizat pentru a observa hipertermofile fără precedent cu microscopie optică standard de înaltă rezoluție în condiții standard (adică sub stres ambiental).
Toate experimentele au fost efectuate folosind un microscop de casă, inclusiv iluminare Köhler (cu LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), suport pentru specimen cu mișcare manuală xy, obiective (Olympus, 60x, 0,7 NA, aer, LUCPlanFLN60X sau 60x, 1,25 NA, ulei) , UPLFLN60XOI), cameră CGM (QLSI cu rețea încrucișată, pas de 39 µm, 0,87 mm de la senzorul camerei Andor Zyla) pentru a oferi imagini de intensitate și front de undă și cameră sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, mod pe 16 biți, de la Hamamatsu) pentru a înregistra datele prezentate în Figura 5 (înot bacterian). Splitter-ul de fascicul dicroic este o margine BrightLine de 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Filtrul de pe partea frontală a camerei este un filtru de trecere scurtă 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Laser cu safir de titan (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, cavitate laser pompată tsunami, Spectra-Physics în Fig. 2-5, înlocuit în continuare cu laser Millenia, Spectraphysics 10 W, cavitate laser Mira pompată, Coerent, pentru Fig. 2 -5). 6 și 7) sunt setate la lungimea de undă \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, care corespunde spectrului de rezonanță plasmonică al nanoparticulelor de aur. Modulatori spațiali de lumină (1920 × 1152 pixeli) au fost achiziționate de la Meadowlark Optics Hologramele au fost calculate folosind algoritmul Gerchberg-Saxton, așa cum este descris în linkul 39.
Microscopia cu front de undă cu rețea încrucișată (CGM) este o tehnică de microscopie optică bazată pe combinarea unei rețele de difracție bidimensionale (cunoscută și sub numele de rețea încrucișată) la o distanță de un milimetru de senzorul unei camere convenționale. Cel mai comun exemplu de CGM pe care l-am folosit în acest studiu este numit interferometru cu deplasare transversală cu patru lungimi de undă (QLSI), în care rețelele încrucișate constă dintr-un model de tablă de șah intensitate/fază introdus și brevetat de Primot și colab. în 200034. Liniile de grilă verticale și orizontale creează pe senzor umbre asemănătoare grilei, a căror distorsiune poate fi procesată numeric în timp real pentru a obține distorsiunea frontului de undă optică (sau profilul de fază echivalent) a luminii incidente. Când este utilizată pe un microscop, o cameră CGM poate afișa diferența de cale optică a unui obiect imagine, cunoscută și sub numele de adâncime optică (OT), cu o sensibilitate de ordinul nanometrilor36. În orice măsurătoare CGM, pentru a elimina orice defecte ale componentelor optice sau fasciculelor, o imagine OT de referință primară trebuie luată și scăzută din orice imagini ulterioare.
Microscopia de temperatură a fost efectuată folosind o cameră CGM așa cum este descris în referință. 32. Pe scurt, încălzirea unui lichid își modifică indicele de refracție, creând un efect de lentilă termică care distorsionează fasciculul incident. Această distorsiune a frontului de undă este măsurată de CGM și procesată folosind un algoritm de deconvoluție pentru a obține o distribuție tridimensională a temperaturii în mediul lichid. Dacă nanoparticulele de aur sunt distribuite uniform în întreaga probă, cartografierea temperaturii se poate face în zone fără bacterii pentru a produce imagini mai bune, ceea ce facem uneori. Imaginea CGM de referință a fost achiziționată fără încălzire (cu laserul oprit) și ulterior capturată în aceeași locație din imagine cu laserul pornit.
Măsurarea masei uscate este realizată folosind aceeași cameră CGM folosită pentru imaginile de temperatură. Imaginile de referință CGM au fost obținute prin mișcarea rapidă a probei în x și y în timpul expunerii, ca mijloc de mediere a oricărei neomogenități în OT din cauza prezenței bacteriilor. Din imaginile OT ale bacteriilor, biomasa acestora a fost obținută folosind un ansamblu de imagini pe zone selectate folosind algoritmul de segmentare de casă al Matlab (vezi subsecțiunea „Cod numeric”), urmând procedura descrisă în ref. 48. Pe scurt, folosim relația \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), unde \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) este imaginea de adâncime optică, \(m\) este greutatea uscată și \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) este o constantă. Am ales \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, care este o constantă tipică pentru celulele vii.
O lamelă de acoperire cu diametrul de 25 mm și grosimea de 150 µm acoperită cu nanoparticule de aur a fost plasată într-o cameră AttofluorTM (Thermofisher) cu nanoparticulele de aur în sus. Geobacillus stearothermophilus a fost precultivat peste noapte în mediu LB (200 rpm, 60°C) înainte de fiecare zi de experimente. O picătură de 5 ui dintr-o suspensie de G. stearothermophilus cu o densitate optică (OD) de 0,3 până la 0,5 a fost plasată pe o lamă de acoperire cu nanoparticule de aur. Apoi, o lamelă rotundă de 18 mm în diametru cu o gaură de 5 mm în diametru în centru a fost aruncată pe picătură și 5 μl de suspensie bacteriană cu aceeași densitate optică au fost aplicate în mod repetat în centrul găurii. Godeurile de pe lamele de acoperire au fost pregătite în conformitate cu procedura descrisă în ref. 45 (a se vedea Informații suplimentare pentru mai multe informații). Apoi adăugați 1 ml de mediu LB pe lamela pentru a preveni uscarea stratului de lichid. Ultima lamelă este plasată peste capacul închis al camerei Attofluor™ pentru a preveni evaporarea mediului în timpul incubației. Pentru experimentele de germinare, am folosit spori, care, după experimente convenționale, uneori acopereau lama superioară. O metodă similară a fost folosită pentru a obține Sulfolobus shibatae. Trei zile (200 rpm, 75°C) de cultivare preliminară a Thiobacillus serrata au fost efectuate în mediu 182 (DSMZ).
Probele de nanoparticule de aur au fost preparate prin litografie micelară cu copolimeri bloc. Acest proces este descris în detaliu în Cap. 60. Pe scurt, miceliile care încapsulează ioni de aur au fost sintetizate prin amestecarea copolimerului cu HAuCI4 în toluen. Lamelele curățate au fost apoi scufundate în soluție și tratate cu iradiere UV în prezența unui agent reducător pentru a obține semințe de aur. În cele din urmă, semințele de aur au fost crescute prin contactarea unei lame de acoperire cu o soluție apoasă de KAuCl4 și etanolamină timp de 16 minute, ceea ce a dus la un aranjament cvasi-periodic și foarte uniform al nanoparticulelor de aur nesferice în infraroșu apropiat.
Pentru a converti interferogramele în imagini OT, am folosit un algoritm de casă, așa cum este detaliat în link. 33 și este disponibil ca pachet Matlab în următorul depozit public: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pachetul poate calcula intensitatea și imaginile OT pe baza interferogramelor înregistrate (inclusiv imagini de referință) și a distanțelor matricei de camere.
Pentru a calcula modelul de fază aplicat SLM pentru a obține un profil de temperatură dat, am folosit un algoritm de casă dezvoltat anterior39,42, care este disponibil în următorul depozit public: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Intrarea este câmpul de temperatură dorit, care poate fi setat digital sau printr-o imagine bmp monocromă.
Pentru a segmenta celulele și a măsura greutatea lor uscată, am folosit algoritmul nostru Matlab publicat în următorul depozit public: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Pe fiecare imagine, utilizatorul trebuie să facă clic pe bacteria sau mCFU de interes, să ajusteze sensibilitatea baghetei și să confirme selecția.
Pentru mai multe informații despre proiectarea studiului, consultați rezumatul Raportului de cercetare în natură legat de acest articol.
Datele care susțin rezultatele acestui studiu sunt disponibile de la autorii respectivi la cerere rezonabilă.
Codul sursă folosit în acest studiu este detaliat în secțiunea Metode, iar versiunile de depanare pot fi descărcate de pe https://github.com/baffou/ în următoarele depozite: SLM_temperatureShaping, CGMprocess și CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. și Sharma, AK Perspectivă asupra termofililor și a aplicațiilor lor cu spectru larg. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. și Sharma, AK Perspectivă asupra termofililor și a aplicațiilor lor cu spectru larg.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. și Sharma, AK Privire de ansamblu asupra termofilelor și aplicarea lor largă. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. și Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. și Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. și Sharma AK O înțelegere profundă a termofililor și o gamă largă de aplicații.3 Biotehnologie 6, 81 (2016).
Ora postării: 26-sept-2022