Boala Alzheimer (AD) nu are biomarkeri proteici care reflectă patofiziologia subiacentă multiplă, împiedicând progresul diagnosticului și tratamentului. Aici, folosim proteomica cuprinzătoare pentru a identifica biomarkerii lichidului cefalorahidian (CSF) care reprezintă o gamă largă de fiziopatologie a AD. Spectrometria de masă multiplex a identificat aproximativ 3.500 și, respectiv, aproximativ 12.000 de proteine în AD LCR și, respectiv, în creier. Analiza de rețea a proteomului creierului a rezolvat 44 de module de biodiversitate, dintre care 15 s-au suprapus cu proteomul lichidului cefalorahidian. Markerii AD LCR din aceste module suprapuse sunt pliați în cinci grupuri de proteine, reprezentând procese fiziopatologice diferite. Sinapsele și metaboliții din creierul AD scad, dar LCR crește, în timp ce mielinizarea bogată în glial și grupurile imune din creier și LCR cresc. Consistența și specificitatea bolii a modificărilor panoului au fost confirmate în mai mult de 500 de probe suplimentare de LCR. Aceste grupuri au identificat, de asemenea, subgrupuri biologice în AD asimptomatică. În general, aceste rezultate sunt un pas promițător către instrumente de biomarkeri bazate pe web pentru aplicații clinice în AD.
Boala Alzheimer (AD) este cea mai frecventă cauză a demenței neurodegenerative la nivel mondial și se caracterizează printr-o gamă largă de disfuncții ale sistemului biologic, inclusiv transmiterea sinaptică, imunitatea mediată de gliale și metabolismul mitocondrial (1-3). Cu toate acestea, biomarkerii proteici consacrați încă se concentrează pe detectarea proteinei amiloid și tau și, prin urmare, nu pot reflecta această patofiziologie diversă. Acești biomarkeri proteici „de bază” care sunt măsurați cel mai fiabil în lichidul cefalorahidian (CSF) includ (i) peptida beta-amiloid 1-42 (Ap1-42), care reflectă formarea plăcilor de amiloid corticale; (ii) tau total, un semn al degenerarii axonilor; (iii) fosfo-tau (p-tau), un reprezentant al hiperfosforilării patologice a tau (4-7). Deși acești biomarkeri ai lichidului cefalorahidian ne-au facilitat foarte mult detectarea bolilor proteinei AD „marcate” (4-7), ei reprezintă doar o mică parte din biologia complexă din spatele bolii.
Lipsa diversității patofiziologice a biomarkerilor AD a condus la multe provocări, inclusiv (i) incapacitatea de a identifica și cuantifica eterogenitatea biologică a pacienților cu AD, (ii) măsurarea insuficientă a severității și progresiei bolii, în special în stadiul preclinic și (ii) iii) dezvoltarea unor medicamente terapeutice care nu au reușit să rezolve complet toate aspectele deteriorării neurologice. Încrederea noastră pe patologia reper pentru a descrie AD din bolile asociate nu face decât să agraveze aceste probleme. Din ce în ce mai multe dovezi arată că majoritatea persoanelor în vârstă cu demență au mai mult de o caracteristică patologică a declinului cognitiv (8). Aproximativ 90% sau mai mult dintre indivizii cu patologie AD au, de asemenea, boli vasculare, incluziuni TDP-43 sau alte boli degenerative (9). Aceste proporții mari de suprapunere patologică au perturbat cadrul nostru actual de diagnostic pentru demență și este necesară o definiție fiziopatologică mai cuprinzătoare a bolii.
Având în vedere nevoia urgentă pentru o varietate de biomarkeri AD, domeniul adoptă din ce în ce mai mult metoda „omică” bazată pe sistemul general de descoperire a biomarkerilor. Alianța Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD a fost lansată în 2014 și este în fruntea programului. Acest efort multidisciplinar al National Institutes of Health, mediul academic și industrie își propune să utilizeze strategii bazate pe sistem pentru a defini mai bine patofiziologia AD și pentru a dezvolta strategii de analiză și tratament de diagnosticare a biodiversității (10). Ca parte a acestui proiect, proteomica rețelei a devenit un instrument promițător pentru avansarea biomarkerilor bazați pe sistem în AD. Această abordare imparțială bazată pe date organizează seturi complexe de date de proteomică în grupuri sau „module” de proteine co-exprimate care sunt asociate cu tipuri specifice de celule, organele și funcții biologice (11-13). Aproape 12 studii de proteomică a rețelei bogate în informații au fost efectuate pe creierul AD (13-23). În general, aceste analize indică faptul că proteomul rețelei cerebrale AD menține o organizare modulară extrem de conservată în cohorte independente și mai multe regiuni corticale. În plus, unele dintre aceste module arată modificări reproductibile ale abundenței legate de AD în seturi de date, reflectând fiziopatologia bolilor multiple. În mod colectiv, aceste descoperiri demonstrează un punct de ancorare promițător pentru descoperirea proteomului rețelei cerebrale ca biomarker bazat pe sistem în AD.
Pentru a transforma proteomul rețelei cerebrale AD în biomarkeri bazați pe sistem utili din punct de vedere clinic, am combinat rețeaua derivată din creier cu analiza proteomică a AD CSF. Această abordare integrată a condus la identificarea a cinci seturi promițătoare de biomarkeri LCR care sunt asociați cu o gamă largă de patofiziologie bazată pe creier, inclusiv sinapsele, vasele de sânge, mielinizarea, inflamația și disfuncția căilor metabolice. Am validat cu succes aceste panouri de biomarkeri prin analize multiple de replicare, inclusiv peste 500 de probe de LCR din diferite boli neurodegenerative. Aceste analize de validare includ examinarea țintelor grupului în LCR al pacienților cu AD asimptomatică (AsymAD) sau evidențierea unei acumulări anormale de amiloid într-un mediu cognitiv normal. Aceste analize evidențiază eterogenitatea biologică semnificativă în populația AsymAD și identifică markeri panou care ar putea fi capabili să subtipeze indivizii în stadiile incipiente ale bolii. În general, aceste rezultate reprezintă un pas cheie în dezvoltarea instrumentelor de biomarker de proteine bazate pe mai multe sisteme care pot rezolva cu succes multe dintre provocările clinice cu care se confruntă AD.
Scopul principal al acestui studiu este de a identifica noi biomarkeri ai lichidului cefalorahidian care reflectă diferite patofiziologii bazate pe creier care duc la AD. Figura S1 subliniază metodologia noastră de cercetare, care include (i) o analiză cuprinzătoare condusă de descoperirile preliminare ale AD LCR și proteomul creierului de rețea pentru a identifica mai mulți biomarkeri ai bolii LCR legați de creier și (ii) replicarea ulterioară Acești biomarkeri sunt în mai multe cefalorahidiane independente. cohorte fluide. Cercetarea orientată spre descoperire a început cu analiza expresiei diferențiale a LCR la 20 de indivizi normali din punct de vedere cognitiv și 20 de pacienți cu AD la Centrul de Cercetare a Bolii Alzheimer Emory Goizueta (ADRC). Diagnosticul de AD este definit ca o afectare cognitivă semnificativă în prezența Aβ1-42 scăzut și a nivelurilor crescute de tau total și p-tau în lichidul cefalorahidian [Evaluare cognitivă medie de la Montreal (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabelul S1A). Martorul (MoCA mediu, 26,7 ± 2,2) a avut niveluri normale de biomarkeri LCR.
LCR uman este caracterizat printr-un interval dinamic de abundență de proteine, în care albumina și alte proteine extrem de abundente pot împiedica detectarea proteinelor de interes (24). Pentru a crește profunzimea descoperirii proteinelor, am eliminat primele 14 proteine foarte abundente din fiecare probă de LCR înainte de analiza spectrometriei de masă (MS) (24). Un total de 39.805 peptide au fost identificate de MS, care au fost mapate la 3691 proteomi în 40 de probe. Cuantificarea proteinelor este realizată prin etichetare multiplă în tandem mass tag (TMT) (18, 25). Pentru a rezolva datele lipsă, am inclus doar acele proteine care au fost cuantificate în cel puțin 50% din probe în analiza ulterioară, cuantificând astfel în final 2875 de proteomi. Datorită diferenței semnificative în nivelurile de abundență totală de proteine, un eșantion de control a fost considerat statistic un valori aberante (13) și nu a fost inclus în analiza ulterioară. Valorile de abundență ale celorlalte 39 de eșantioane au fost ajustate în funcție de vârstă, sex și covarianța lotului (13-15, 17, 18, 20, 26).
Folosind analiza statistică a testului t pentru a evalua expresia diferențială pe setul de date de regresie, această analiză a identificat proteine ale căror niveluri de abundență au fost modificate semnificativ (P <0,05) între cazurile martor și AD (Tabelul S2A). După cum se arată în Figura 1A, abundența unui total de 225 de proteine în AD a fost redusă semnificativ, iar abundența a 303 proteine a fost semnificativ crescută. Aceste proteine exprimate diferențial includ câțiva markeri AD de lichid cefalorahidian identificați anterior, cum ar fi proteina tau asociată cu microtubuli (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10−3), proteină legată de creștere 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Chitinaza 3 similară 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Granulină neuronală (NRGN; P = 3,43 × 10−4) și factorul de creștere a nervilor VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Cu toate acestea, am identificat și alte ținte foarte importante, cum ar fi inhibitorul de disociere GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) și legarea modulară de calciu legată de SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Analiza Ontologiei genetice (GO) a 225 de proteine semnificativ reduse a evidențiat conexiuni strânse cu procesele fluidelor corporale, cum ar fi metabolismul steroizilor, coagularea sângelui și activitatea hormonală (Figura 1B și Tabelul S2B). În schimb, proteina crescută semnificativ a 303 este strâns legată de structura celulară și metabolismul energetic.
(A) Graficul vulcanului arată modificarea log2 de ori (axa x) în raport cu valoarea P statistică -log10 (axa y) obținută prin testul t, care este utilizat pentru a detecta expresia diferențială între control (CT) și Cazuri AD ale proteomului LCR Dintre toate proteinele. Proteinele cu niveluri semnificativ reduse (P <0,05) în AD sunt afișate cu albastru, în timp ce proteinele cu niveluri semnificativ crescute de boală sunt afișate cu roșu. Proteina selectată este marcată. (B) Termenii de top GO legați de proteine sunt semnificativ reduse (albastru) și crescute (roșu) în AD. Afișează cei trei termeni GO cu cele mai mari scoruri z în domeniile proceselor biologice, funcțiilor moleculare și componentelor celulare. (C) MS a măsurat nivelul MAPT în proba de LCR (stânga) și corelarea acestuia cu nivelul ELISA tau al eșantionului (dreapta). Este afișat coeficientul de corelație Pearson cu valoarea P relevantă. Din cauza lipsei datelor ELISA pentru un caz de AD, aceste cifre includ valori pentru 38 din cele 39 de cazuri analizate. (D) Analiza grupului supravegheată (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) ajustat P <0,01) pe controlul și AD CSF a găsit probe folosind cele 65 de proteine cele mai semnificativ modificate din setul de date. Standardizați, normalizați.
Nivelul proteomic al MAPT este strâns legat de nivelul ELISA tau măsurat independent (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Figura 1C), susținând validitatea măsurării noastre MS. După digestia tripsinei la nivelul proteinei precursoare de amiloid (APP), peptidele specifice izoformei mapate la capătul C-terminal al Ap1-40 și Ap1-42 nu pot fi ionizate eficient (27, 28). Prin urmare, peptidele APP pe care le-am identificat nu au nimic de-a face cu nivelurile ELISA Aβ1-42. Pentru a evalua expresia diferențială a fiecărui caz, am folosit proteine exprimate diferențial cu P <0,0001 [rată de descoperire falsă (FDR) corectată P <0,01] pentru a efectua o analiză grupată supravegheată a probelor (Tabelul S2A). După cum se arată în Figura 1D, aceste 65 de proteine foarte semnificative pot grupa corect probe în funcție de starea bolii, cu excepția unui caz AD cu caracteristici asemănătoare controlului. Dintre aceste 65 de proteine, 63 au crescut în AD, în timp ce doar două (CD74 și ISLR) au scăzut. În total, aceste analize ale lichidului cefalorahidian au identificat sute de proteine în AD care pot servi drept biomarkeri ai bolii.
Apoi am efectuat o analiză independentă a rețelei a proteomului creierului AD. Cohorta de creier a acestei descoperiri a inclus cortexul prefrontal dorsolateral (DLPFC) de la control (n = 10), boala Parkinson (PD; n = 10), cazuri mixte de AD/PD (n = 10) și AD (n = 10). ) Probă. Emery Goizueta ADRC. Datele demografice ale acestor 40 de cazuri au fost descrise anterior (25) și sunt rezumate în Tabelul S1B. Am folosit TMT-MS pentru a analiza aceste 40 de țesuturi cerebrale și cohorta de replicare a 27 de cazuri. În total, aceste două seturi de date despre creier au produs 227.121 de peptide unice, care au fost mapate la 12.943 de proteomi (25). Doar acele proteine care au fost cuantificate în cel puțin 50% din cazuri au fost incluse în investigațiile ulterioare. Setul de date de descoperire finală conține 8817 proteine cuantificate. Ajustați nivelurile de abundență de proteine în funcție de vârstă, sex și intervalul post-mortem (PMI). Analiza expresiei diferențiale a setului de date după regresie a arătat că > 2000 de niveluri de proteine au fost modificate semnificativ [P <0,05, analiza varianței (ANOVA)] în două sau mai multe cohorte de boală. Apoi, am efectuat o analiză de grup supravegheată bazată pe proteinele exprimate diferențial și P <0,0001 în comparațiile AD/control și/sau AD/PD (Figura S2, A și B, Tabelul S2C). Aceste 165 de proteine foarte modificate descriu în mod clar cazurile cu patologie AD din probele de control și PD, confirmând modificările puternice specifice AD în întregul proteom.
Am folosit apoi un algoritm numit Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) pentru a efectua analize de rețea pe proteomul cerebral descoperit, care organizează setul de date în module de proteine cu modele de expresie similare (11-13). Analiza a identificat 44 de module (M) proteine co-exprimate, sortate și numerotate de la cel mai mare (M1, n = 1821 proteine) la cel mai mic (M44, n = 34 proteine) (Figura 2A și Tabelul S2D). După cum sa menționat mai sus (13) Calculați profilul de expresie reprezentativ sau proteina caracteristică a fiecărui modul și corelați-l cu starea bolii și patologia AD, adică stabiliți alianța Registrului bolii Alzheimer (CERAD) și Scorul Braak (Figura 2B). În general, 17 module au fost semnificativ legate de neuropatologia AD (P <0,05). Multe dintre aceste module legate de boală sunt, de asemenea, bogate în markeri specifici tipului de celule (Figura 2B). După cum sa menționat mai sus (13), îmbogățirea tipului de celule este determinată prin analizarea suprapunerii modulelor și a listei de referință a genelor specifice tipului de celule. Aceste gene sunt derivate din datele publicate în neuroni de șoarece izolați, celule endoteliale și gliale. Experimentul de secvențiere a ARN (ARN-seq) (29).
(A) Descoperiți WGCNA al proteomului creierului. (B) Analiza de corelație biponderală (BiCor) a proteinei semnături modulare (prima componentă majoră a expresiei proteinei modulare) cu caracteristici neuropatologice AD (sus), inclusiv scorurile CERAD (placă Aβ) și Braak (încurcături tau). Intensitățile corelațiilor pozitive (roșu) și negative (albastru) sunt afișate printr-o hartă termică în două culori, iar asteriscurile indică semnificația statistică (P <0,05). Utilizați Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (de jos) pentru a evalua asocierea tipului de celule a fiecărui modul proteic. Intensitatea umbririi roșii indică gradul de îmbogățire a tipului de celule, iar asteriscul indică semnificația statistică (P <0,05). Utilizați metoda BH pentru a corecta valoarea P derivată din FET. (C) Analiza GO a proteinelor modulare. Procesele biologice cele mai strâns legate sunt prezentate pentru fiecare modul sau grup de module înrudit. oligo, oligodendrocit.
Un set de cinci module strâns legate de astrocite și microglia (M30, M29, M18, M24 și M5) au arătat o corelație pozitivă puternică cu neuropatologia AD (Figura 2B). Analiza ontologiei leagă aceste module gliale cu creșterea celulelor, proliferarea și imunitatea (Figura 2C și Tabelul S2E). Două module gliale suplimentare, M8 și M22, sunt, de asemenea, puternic reglate în boală. M8 este foarte legat de calea receptorului Toll-like, o cascadă de semnalizare care joacă un rol cheie în răspunsul imun înnăscut (30). În același timp, M22 este strâns legat de modificarea post-traducțională. M2, care este bogat în oligodendrocite, prezintă o corelație pozitivă puternică cu patologia AD și o legătură ontologică cu sinteza nucleozidelor și replicarea ADN-ului, indicând o proliferare celulară îmbunătățită în boli. În general, aceste constatări susțin creșterea modulelor gliale pe care le-am observat anterior în proteomul rețelei AD (13, 17). În prezent, se constată că multe module gliale legate de AD din rețea prezintă niveluri de expresie mai scăzute în cazurile de control și PD, evidențiind specificitatea bolii lor, care este crescută în AD (Figura S2C).
Doar patru module din proteomul nostru de rețea (M1, M3, M10 și M32) sunt puternic corelate negativ cu patologia AD (P <0,05) (Figura 2, B și C). Atât M1 cât și M3 sunt bogate în markeri neuronali. M1 este strâns legat de semnalele sinaptice, în timp ce M3 este strâns legat de funcția mitocondrială. Nu există dovezi de îmbogățire a tipului de celule pentru M10 și M32. M32 reflectă conexiunea dintre M3 și metabolismul celular, în timp ce M10 este foarte legat de creșterea celulară și de funcția microtubulilor. În comparație cu AD, toate cele patru module sunt crescute în control și PD, dându-le modificări AD specifice bolii (Figura S2C). În general, aceste rezultate susțin abundența scăzută de module bogate în neuroni pe care le-am observat anterior în AD (13, 17). Pe scurt, analiza rețelei a proteomului cerebral pe care am descoperit-o a produs module modificate în mod specific AD, în concordanță cu descoperirile noastre anterioare.
AD este caracterizată printr-un stadiu incipient asimptomatic (AsymAD), în care indivizii prezintă acumulare de amiloid fără declin cognitiv clinic (5, 31). Această etapă asimptomatică reprezintă o fereastră critică pentru depistarea și intervenția precoce. Am demonstrat anterior o conservare modulară puternică a proteomului rețelei cerebrale AsymAD și AD în seturi de date independente (13, 17). Pentru a ne asigura că rețeaua cerebrală pe care am descoperit-o în prezent este în concordanță cu aceste descoperiri anterioare, am analizat conservarea a 44 de module în setul de date replicat de la 27 de organizații DLPFC. Aceste organizații includ cazuri de control (n = 10), AsymAD (n = 8) și AD (n = 9). Probele de control și AD au fost incluse în analiza cohortei noastre de creier descoperire (Tabelul S1B), în timp ce cazurile AsymAD au fost unice numai în cohorta de replicare. Aceste cazuri AsymAD au venit și de la banca de creier Emory Goizueta ADRC. Deși cogniția era normală la momentul morții, nivelurile de amiloid au fost anormal de ridicate (CERAD mediu, 2,8 ± 0,5) (Tabelul S1B).
Analiza TMT-MS a acestor 27 de țesuturi cerebrale a dus la cuantificarea a 11.244 de proteomi. Acest număr final include numai acele proteine cuantificate în cel puțin 50% din probe. Acest set de date replicate conține 8638 (98,0%) dintre cele 8817 proteine detectate în analiza noastră de descoperire a creierului și are aproape 3000 de proteine modificate semnificativ între cohortele de control și AD (P <0,05, după testul t pereche al lui Tukey pentru analiza varianței) ( Tabelul S2F). Printre aceste proteine exprimate diferențial, 910 a arătat, de asemenea, modificări semnificative ale nivelului între cazurile de control ale AD și proteom al creierului (P <0,05, după testul t pereche ANOVA Tukey). Este demn de remarcat faptul că acești markeri 910 sunt foarte consecvenți în direcția schimbării dintre proteomi (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Figura S3A). Dintre proteinele crescute, proteinele cu cele mai consistente modificări între seturile de date sunt în principal membri ai modulelor M5 și M18 bogate în glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 și GFAP). Dintre proteinele reduse, cele cu cele mai consistente modificări au fost aproape exclusiv membri ai modulului M1 (NPTX2, VGF și RPH3A) asociate cu sinapsa. Am verificat în continuare modificările legate de AD ale midkine (MDK), CD44, proteinei secretate înrudite 1 (SFRP1) și VGF prin western blot (Figura S3B). Analiza de conservare a modulelor a arătat că aproximativ 80% dintre modulele de proteine (34/44) din proteomul creierului au fost conservate semnificativ în setul de date de replicare (z-score> 1,96, P corectat FDR <0,05) (Figura S3C). Paisprezece dintre aceste module au fost special rezervate între cei doi proteomi (z-score> 10, FDR corectat P <1,0 × 10-23). În general, descoperirea și replicarea gradului ridicat de consistență în expresia diferențială și compoziția modulară între proteomul creierului evidențiază reproductibilitatea modificărilor proteinelor cortexului frontal AD. În plus, a confirmat, de asemenea, că AsymAD și bolile mai avansate au o structură a rețelei cerebrale foarte asemănătoare.
O analiză mai detaliată a expresiei diferențiale în setul de date de replicare a creierului evidențiază gradul semnificativ de modificări ale proteinei AsymAD, inclusiv un total de 151 de proteine modificate semnificativ între AsymAD și control (P <0,05) (Figura S3D). În concordanță cu încărcarea cu amiloid, APP în creierul AsymAD și AD a crescut semnificativ. MAPT se schimbă doar semnificativ în AD, ceea ce este în concordanță cu nivelurile crescute de încurcături și corelația sa cunoscută cu declinul cognitiv (5, 7). Modulele bogate în gliale (M5 și M18) sunt foarte reflectate în proteinele crescute în AsymAD, în timp ce modulul M1 legat de neuroni este cel mai reprezentativ dintre proteinele scăzute din AsymAD. Mulți dintre acești markeri AsymAD arată schimbări mai mari în bolile simptomatice. Printre acești markeri se numără SMOC1, o proteină glială aparținând lui M18, care este asociată cu tumorile cerebrale și dezvoltarea ochilor și a membrelor (32). MDK este un factor de creștere care leagă heparina legat de creșterea celulelor și angiogeneza (33), un alt membru al M18. Comparativ cu grupul de control, AsymAD a crescut semnificativ, urmată de o creștere mai mare a AD. În schimb, proteina sinaptică neuropentraxină 2 (NPTX2) a fost redusă semnificativ în creierul AsymAD. NPTX2 a fost anterior asociat cu neurodegenerarea și are un rol recunoscut în mediarea sinapselor excitatorii (34). În general, aceste rezultate dezvăluie o varietate de modificări preclinice diferite ale proteinelor în AD, care par să progreseze odată cu severitatea bolii.
Având în vedere că am atins o adâncime semnificativă a acoperirii proteinelor în descoperirea proteomului creierului, încercăm să înțelegem mai pe deplin suprapunerea acestuia cu transcriptomul AD la nivel de rețea. Prin urmare, am comparat proteomul cerebral pe care l-am descoperit cu modulul pe care l-am generat anterior din măsurarea cu microarray a 18.204 gene în țesuturile DLPFC AD (n = 308) și control (n = 157) (13). suprapuse. În total, am identificat 20 de module ARN diferite, dintre care multe au demonstrat îmbogățirea unor tipuri de celule specifice, inclusiv neuroni, oligodendrocite, astrocite și microglia (Figura 3A). Modificările multiple ale acestor module în AD sunt prezentate în Figura 3B. În concordanță cu analiza noastră anterioară de suprapunere proteină-ARN folosind proteomul MS nemarcat mai profund (aproximativ 3000 de proteine) (13), majoritatea celor 44 de module din rețeaua de proteomi cerebrali pe care le-am găsit sunt în rețeaua de transcriptom. Nu există o suprapunere semnificativă. Chiar și în descoperirea și replicarea noastră a celor 34 de module de proteine care sunt foarte reținute în proteomul creierului, doar 14 (~40%) au trecut testul exact al lui Fisher (FET) s-au dovedit a avea o suprapunere semnificativă statistic cu transcriptomul (Figura 3A). Compatibil cu repararea daunelor ADN (P-M25 și P-M19), traducerea proteinelor (P-M7 și P-M20), legarea/splicingul ARN (P-M16 și P-M21) și țintirea proteinelor (P-M13 și P-). M23) nu se suprapune cu modulele din transcriptom. Prin urmare, deși un set de date mai profund de proteom este utilizat în analiza de suprapunere curentă (13), cea mai mare parte a proteomului rețelei AD nu este mapată la rețeaua de transcriptom.
(A) FET hipergeometric demonstrează îmbogățirea markerilor specifici tipului de celule în modulul ARN al transcriptomului AD (sus) și gradul de suprapunere între modulele ARN (axa x) și proteine (axa y) ale creierului AD (jos). Intensitatea umbririi roșii indică gradul de îmbogățire a tipurilor de celule din panoul superior și intensitatea suprapunerii modulelor din panoul de jos. Asteriscurile indică semnificația statistică (P <0,05). (B) Gradul de corelare dintre genele caracteristice ale fiecărui modul de transcriptom și starea AD. Modulele din stânga sunt cele mai negativ corelate cu AD (albastru), iar cele din dreapta sunt cele mai pozitiv corelate cu AD (roșu). Valoarea P corectată cu BH transformată în log indică gradul de semnificație statistică a fiecărei corelații. (C) Module suprapuse semnificative cu îmbogățirea tipului de celule partajate. (D) Analiza corelației modificării log2 a proteinei marcate (axa x) și ARN (axa y) în modulul de suprapunere. Este afișat coeficientul de corelație Pearson cu valoarea P relevantă. Micro, microglia; corpuri cerești, astrocite. CT, control.
Cele mai multe module de proteine și ARN care se suprapun, împărtășesc profiluri similare de îmbogățire a tipului de celule și direcții consecvente de schimbare a AD (Figura 3, B și C). Cu alte cuvinte, modulul M1 legat de sinapse al proteomului cerebral (PM1) este mapat la trei module de ARN omoloage bogate în neuroni (R-M1, R-M9 și R-M16), care sunt în AD Ambele au arătat un nivel redus. În mod similar, modulele proteinelor M5 și M18 bogate în gliale se suprapun cu modulele ARN bogate în astrocite și markeri microgliali (R-M3, R-M7 și R-M10) și sunt foarte implicate în boli. Aceste caracteristici modulare partajate între cele două seturi de date susțin în continuare îmbogățirea tipului de celule și modificările legate de boală pe care le-am observat în proteomul creierului. Cu toate acestea, am observat multe diferențe semnificative între nivelurile de ARN și proteine ale markerilor individuali în aceste module partajate. Analiza corelației exprimării diferențiale a proteomicelor și transcriptomicelor moleculelor din aceste module suprapuse (Figura 3D) evidențiază această inconsecvență. De exemplu, APP și alte câteva proteine din modulul glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 și SFRP1) au arătat o creștere semnificativă a proteomului AD, dar nu a existat aproape nicio modificare a transcriptomului AD. Aceste modificări specifice proteinei pot fi strâns legate de plăcile de amiloid (23, 35), evidențiind proteomul ca sursă a modificărilor patologice, iar aceste modificări pot să nu fie reflectate în transcriptom.
După ce am analizat în mod independent proteoamele creierului și CSF pe care le-am descoperit, am efectuat o analiză cuprinzătoare a celor două seturi de date pentru a identifica biomarkerii AD CSF legați de patofiziologia rețelei cerebrale. Mai întâi trebuie să definim suprapunerea celor doi proteomi. Deși este larg acceptat că LCR reflectă modificări neurochimice în creierul AD (4), gradul exact de suprapunere între creierul AD și proteomul LCR este neclar. Comparând numărul de produse genetice comune detectate în cei doi proteomi ai noștri, am constatat că aproape 70% (n = 1936) dintre proteinele identificate în lichidul cefalorahidian au fost, de asemenea, cuantificate în creier (Figura 4A). Cele mai multe dintre aceste proteine care se suprapun (n = 1721) sunt mapate la unul dintre cele 44 de module de co-expresie din setul de date pentru descoperirea creierului (Figura 4B). După cum era de așteptat, cele mai mari șase module ale creierului (M1 la M6) au prezentat cea mai mare cantitate de suprapunere LCR. Cu toate acestea, există module cerebrale mai mici (de exemplu, M15 și M29) care ating un grad neașteptat de mare de suprapunere, mai mare decât un modul cerebral de două ori dimensiunea lui. Acest lucru ne motivează să adoptăm o metodă mai detaliată, bazată pe statistici, pentru a calcula suprapunerea dintre creier și lichidul cefalorahidian.
(A și B) Proteinele detectate în seturile de date ale creierului de descoperire și CSF se suprapun. Cele mai multe dintre aceste proteine care se suprapun sunt asociate cu unul dintre cele 44 de module de co-expresie ale rețelei de co-expresie a creierului. (C) Descoperiți suprapunerea dintre proteomul lichidului cefalorahidian și proteomul rețelei cerebrale. Fiecare rând al hărții termice reprezintă o analiză separată de suprapunere a FET-ului hipergeometric. Rândul de sus ilustrează suprapunerea (umbrire gri/negru) dintre modulul creierului și întregul proteom LCR. A doua linie arată că suprapunerea dintre modulele creierului și proteina LCR (umbrită în roșu) este semnificativ reglată în AD (P <0,05). Al treilea rând arată că suprapunerea dintre modulele creierului și proteina LCR (umbrire albastră) este semnificativ redusă în AD (P <0,05). Utilizați metoda BH pentru a corecta valoarea P derivată din FET. (D) Panoul modulului pliabil pe baza asocierii tipului de celule și a termenilor GO aferenti. Aceste panouri conțin un total de 271 de proteine legate de creier, care au o expresie diferențială semnificativă în proteomul LCR.
Folosind FET-uri cu o singură coadă, am evaluat importanța suprapunerii proteinelor între proteomul CSF și modulele individuale ale creierului. Analiza a arătat că un total de 14 module cerebrale din setul de date CSF au suprapuneri semnificative statistic (FDR ajustat P <0,05) și un modul suplimentar (M18) a cărui suprapunere este aproape de semnificație (FDR ajustat P = 0,06) (Figura 4C). , rândul de sus). Suntem, de asemenea, interesați de modulele care se suprapun puternic cu proteinele CSF exprimate diferențial. Prin urmare, am aplicat două analize FET suplimentare pentru a determina care dintre (i) proteina LCR a fost crescută semnificativ în AD și (ii) proteina LCR a scăzut semnificativ în AD (P <0,05, test t pereche AD/control) Modulele cerebrale cu suprapunere semnificativă între ei. După cum se arată în rândurile din mijloc și de jos din Figura 4C, aceste analize suplimentare arată că 8 dintre cele 44 de module ale creierului se suprapun semnificativ cu proteina adăugată în AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 și M38) . ), în timp ce doar două module (M6 și M15) au arătat o suprapunere semnificativă cu proteina redusă din AD CSF. După cum era de așteptat, toate cele 10 module sunt în cele 15 module cu cea mai mare suprapunere cu proteomul CSF. Prin urmare, presupunem că aceste 15 module sunt surse cu randament ridicat de biomarkeri LCR derivati din creier AD.
Am împăturit aceste 15 module suprapuse în cinci panouri mari de proteine pe baza proximității lor în diagrama arborelui WGCNA și asocierea lor cu tipurile de celule și ontologia genelor (Figura 4D). Primul panou conține module bogate în markeri de neuroni și proteine legate de sinapse (M1 și M12). Panoul sinaptic conține un total de 94 de proteine, iar nivelurile din proteomul LCR s-au schimbat semnificativ, făcându-l cea mai mare sursă de markeri LCR legați de creier dintre cele cinci panouri. Al doilea grup (M6 și M15) a demonstrat legătura strânsă cu markerii celulelor endoteliale și corpul vascular, cum ar fi „vindecarea rănilor” (M6) și „reglarea răspunsului imun umoral” (M15). M15 este, de asemenea, puternic legat de metabolismul lipoproteinelor, care este strâns legat de endoteliu (36). Panoul vascular conține 34 de markeri LCR legați de creier. Al treilea grup include module (M2 și M4) care sunt semnificativ legate de markerii oligodendrocitelor și proliferarea celulară. De exemplu, termenii de ontologie de nivel superior ai M2 includ „reglarea pozitivă a replicării ADN” și „procesul de biosinteză a purinelor”. Între timp, cele ale M4 includ „diferențierea celulelor gliale” și „segregarea cromozomilor”. Panoul de mielinizare conține 49 de markeri LCR legați de creier.
Al patrulea grup conține cele mai multe module (M30, M29, M18, M24 și M5) și aproape toate modulele sunt semnificativ bogate în markeri de microglia și astrocite. Similar cu panoul de mielinizare, al patrulea panou conține, de asemenea, module (M30, M29 și M18) care sunt strâns legate de proliferarea celulară. Celelalte module din acest grup sunt strâns legate de termeni imunologici, cum ar fi „procesul efectului imun” (M5) și „reglarea răspunsului imun” (M24). Grupul imun glial conține 42 de markeri LCR legați de creier. În cele din urmă, ultimul panou include 52 de markeri legați de creier pe cele patru module (M44, M3, M33 și M38), toate fiind pe corp legate de stocarea energiei și metabolism. Cel mai mare dintre aceste module (M3) este strâns legat de mitocondrii și este bogat în markeri specifici neuronilor. M38 este unul dintre membrii modulului mai mici din acest metabolom și prezintă, de asemenea, o specificitate moderată a neuronilor.
În general, aceste cinci panouri reflectă o gamă largă de tipuri și funcții de celule în cortexul AD și conțin în mod colectiv 271 de markeri LCR legați de creier (Tabelul S2G). Pentru a evalua validitatea acestor rezultate MS, am folosit testul de extensie de proximitate (PEA), o tehnologie bazată pe anticorpi ortogonali cu capacități de multiplexare, sensibilitate și specificitate ridicate și am reanalizat probele de lichid cefalorahidian, am găsit un subset din acești 271 de biomarkeri. (n = 36). Aceste 36 de obiective demonstrează schimbarea multiplu AD al PEA, care este strâns legată de constatările noastre bazate pe MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), care a verificat cu tărie rezultatele analizei noastre cuprinzătoare MS (Figura S4). ).
Temele biologice evidențiate de cele cinci grupuri ale noastre, de la semnalizarea sinaptică la metabolismul energetic, sunt toate legate de patogeneza AD (1-3). Prin urmare, toate cele 15 module care conțin aceste panouri sunt legate de patologia AD din proteomul creierului pe care l-am descoperit (Figura 2B). Cea mai notabilă este corelația patologică pozitivă ridicată dintre modulele noastre gliale și corelația patologică negativă puternică dintre cele mai mari module neuronale ale noastre (M1 și M3). Analiza expresiei diferențiale a proteomului creierului nostru replicat (Figura S3D) evidențiază, de asemenea, proteinele gliale derivate din M5 și M18. În AsymAD și AD simptomatică, proteinele gliale cele mai crescute și sinapsele legate de M1 Proteina este redusă cel mai mult. Aceste observații indică faptul că cei 271 de markeri de lichid cefalorahidian pe care i-am identificat în cele cinci grupuri sunt legați de procesele bolii din cortexul AD, inclusiv cele care apar în stadiile incipiente asimptomatice.
Pentru a analiza mai bine direcția de schimbare a proteinelor panoului din creier și lichidul spinal, am trasat următoarele pentru fiecare dintre cele 15 module suprapuse: (i) a găsit nivelul de abundență al modulului în setul de date despre creier și (ii) modulul. proteină Diferența este exprimată în lichidul cefalorahidian (Figura S5). După cum sa menționat mai devreme, WGCNA este utilizat pentru a determina abundența modulului sau valoarea caracteristică a proteinei din creier (13). Harta vulcanilor este folosită pentru a descrie expresia diferențială a proteinelor modulare în lichidul cefalorahidian (AD/control). Aceste cifre arată că trei dintre cele cinci panouri arată tendințe diferite de exprimare în creier și lichidul spinal. Cele două module ale panoului sinapselor (M1 și M12) arată o scădere a nivelului de abundență în creierul AD, dar se suprapun semnificativ cu proteina crescută în AD CSF (Figura S5A). Modulele legate de neuroni care conțin metabolomul (M3 și M38) au prezentat modele similare de expresie a creierului și a lichidului cefalorahidian inconsecvente (Figura S5E). Panoul vascular a arătat, de asemenea, tendințe de expresie diferite, deși modulele sale (M6 și M15) au fost moderat crescute în creierul AD și au scăzut în LCR bolnav (Figura S5B). Celelalte două panouri conțin rețele gliale mari ale căror proteine sunt regulate în mod constant în ambele compartimente (Figura S5, C și D).
Vă rugăm să rețineți că aceste tendințe nu sunt comune tuturor marcatorilor din aceste panouri. De exemplu, panoul sinaptic include mai multe proteine care sunt reduse semnificativ în creierul AD și LCR (Figura S5A). Printre acești markeri de lichid cefalorahidian reglați în jos sunt NPTX2 și VGF din M1 și cromogranina B din M12. Cu toate acestea, în ciuda acestor excepții, majoritatea markerilor noștri sinaptici sunt crescuti în lichidul spinal AD. În general, aceste analize au reușit să distingă tendințele semnificative statistic ale nivelurilor creierului și ale lichidului cefalorahidian în fiecare dintre cele cinci panouri ale noastre. Aceste tendințe evidențiază relația complexă și adesea diferită dintre expresia proteinei din creier și CSF în AD.
Apoi, am folosit analiza de replicare MS cu randament ridicat (replicarea CSF 1) pentru a restrânge setul nostru de 271 de biomarkeri la cele mai promițătoare și reproductibile ținte (Figura 5A). CSF copia 1 conține un total de 96 de eșantioane din Emory Goizueta ADRC, inclusiv control, AsymAD și cohorta AD (Tabelul S1A). Aceste cazuri de AD sunt caracterizate prin declin cognitiv ușor (MoCA mediu, 20,0 ± 3,8) și modificări ale biomarkerilor AD confirmate în lichidul cefalorahidian (Tabelul S1A). Spre deosebire de analiza LCR pe care am găsit-o, această replicare este efectuată utilizând o metodă MS „single-shot” mai eficientă și de mare performanță (fără fracționare off-line), inclusiv un protocol simplificat de preparare a probei care elimină necesitatea imunodepleției probelor individuale. . În schimb, un singur „canal de îmbunătățire” cu imunitatea epuizată este utilizat pentru a amplifica semnalul proteinelor mai puțin abundente (37). Deși reduce acoperirea totală a proteomului, această metodă cu o singură injecție reduce semnificativ timpul de mașină și crește numărul de probe marcate cu TMT care pot fi analizate viabile (17, 38). În total, analiza a identificat 6.487 de peptide, care au reprezentat 1.183 de proteomi în 96 de cazuri. Ca și în cazul analizei LCR pe care le-am găsit, doar acele proteine cuantificate în cel puțin 50% din probe au fost incluse în calculele ulterioare, iar datele au fost regresate pentru efectele vârstei și sexului. Acest lucru a condus la cuantificarea finală a 792 de proteomi, dintre care 95% au fost identificați și în setul de date CSF găsit.
(A) Ținte ale proteinei LCR legate de creier verificate în prima cohortă LCR replicată și incluse în panoul final (n = 60). (B la E) Nivelurile biomarkerilor de panou (scoruri z compozite) măsurate în cele patru cohorte de replicare a LCR. Testele t pereche sau ANOVA cu post-corecția lui Tukey au fost utilizate pentru a evalua semnificația statistică a modificărilor abundenței în fiecare analiză replicată. CT, control.
Deoarece suntem în mod deosebit interesați de verificarea celor 271 ținte ale LCR legate de creier prin analiză cuprinzătoare, vom limita examinarea ulterioară a acestui proteom replicat la acești markeri. Dintre aceste 271 de proteine, 100 au fost detectate în replicarea LCR 1. Figura S6A arată expresia diferențială a acestor 100 de markeri suprapuneri între probele de control și replicarea AD. Histonele sinaptice și metabolite cresc cel mai mult în AD, în timp ce proteinele vasculare scad cel mai mult în boală. Majoritatea celor 100 de markeri suprapusi (n = 70) au menținut aceeași direcție de schimbare în cele două seturi de date (Figura S6B). Acești 70 de markeri LCR legați de creier validați (Tabelul S2H) reflectă în mare măsură tendințele de exprimare a panoului observate anterior, adică reglarea în jos a proteinelor vasculare și reglarea în sus a tuturor celorlalte panouri. Doar 10 dintre aceste 70 de proteine validate au prezentat modificări ale abundenței AD care au contrazis aceste tendințe ale panoului. Pentru a genera un panou care reflectă cel mai bine tendința generală a creierului și a lichidului cefalorahidian, am exclus aceste 10 proteine din panoul de interes pe care l-am verificat în cele din urmă (Figura 5A). Prin urmare, panoul nostru include în cele din urmă un total de 60 de proteine verificate în două cohorte independente de LCR AD, folosind diferite pregătiri ale probei și analize ale platformei MS. Graficele de expresie cu scorul z ale acestor panouri finale în cazul de control al copiei 1 CSF și cazurile AD au confirmat tendința panoului observată în cohorta CSF pe care am găsit-o (Figura 5B).
Printre aceste 60 de proteine, există molecule cunoscute a fi asociate cu AD, cum ar fi osteopontina (SPP1), care este o citokină proinflamatoare care a fost asociată cu AD în multe studii (39-41) și GAP43, proteină sinaptică A. care este în mod clar legat de neurodegenerare (42). Proteinele cele mai pe deplin verificate sunt markerii legați de alte boli neurodegenerative, cum ar fi superoxid dismutaza 1 (SOD1) legată de scleroza laterală amiotrofică (ALS) și dezacaraza asociată bolii Parkinson (PARK7). Am verificat, de asemenea, că mulți alți markeri, cum ar fi SMOC1 și proteina 1 de semnalizare a atașării membranei bogate în creier (BASP1), au legături anterioare limitate cu neurodegenerarea. Este demn de remarcat faptul că, din cauza abundenței lor scăzute în proteomul CSF, este dificil pentru noi să folosim această metodă de detectare cu un singur tir de mare performanță pentru a detecta în mod fiabil MAPT și anumite alte proteine legate de AD (de exemplu, NEFL și NRGN). ) ( 43, 44).
Apoi am verificat acești 60 de markeri de panouri prioritare în trei analize repetate suplimentare. În CSF Copy 2, am folosit un singur TMT-MS pentru a analiza o cohortă independentă de 297 de probe de control și AD de la Emory Goizueta ADRC (17). Replicarea LCR 3 a inclus o reanaliza a datelor disponibile TMT-MS de la 120 de pacienți de control și AD din Lausanne, Elveția (45). Am detectat mai mult de două treimi din cei 60 de markeri de prioritate din fiecare set de date. Deși studiul elvețian a folosit diferite platforme MS și metode de cuantificare TMT (45, 46), am reprodus puternic tendințele panoului nostru în două analize repetate (Figura 5, C și D și tabelele S2, I și J). Pentru a evalua specificitatea bolii a grupului nostru, am folosit TMT-MS pentru a analiza cel de-al patrulea set de date de replicare (replicarea LCR 4), care a inclus nu numai cazuri de control (n = 18) și AD (n = 17), ci și cazuri de PD ( n = 14)), SLA (n = 18) și probe de demență frontotemporală (FTD) (n = 11) (Tabelul S1A). Am cuantificat cu succes aproape două treimi din proteinele panoului din această cohortă (38 din 60). Aceste rezultate evidențiază modificările specifice AD în toate cele cinci panouri de biomarkeri (Figura 5E și Tabelul S2K). Creșterea grupului de metaboliți a arătat cea mai puternică specificitate AD, urmată de grupul de mielinizare și glial. Într-o măsură mai mică, FTD arată, de asemenea, o creștere între aceste panouri, care poate reflecta schimbări potențiale similare în rețea (17). În schimb, ALS și PD au prezentat aproape aceleași profiluri de mielinizare, glială și metabolom ca și grupul de control. În general, în ciuda diferențelor în pregătirea probei, platforma MS și metodele de cuantificare TMT, aceste analize repetate arată că markerii noștri prioritari au modificări specifice AD foarte consistente în mai mult de 500 de probe unice de LCR.
Neurodegenerarea AD a fost recunoscută pe scară largă cu câțiva ani înainte de apariția simptomelor cognitive, deci există o nevoie urgentă de biomarkeri ai AsymAD (5, 31). Cu toate acestea, din ce în ce mai multe dovezi arată că biologia AsymAD este departe de a fi omogenă, iar interacțiunea complexă a riscului și rezistenței duce la diferențe individuale mari în progresia ulterioară a bolii (47). Deși sunt utilizate pentru a identifica cazurile de AsymAD, nivelurile biomarkerilor de bază LCR (Aβ1-42, tau total și p-tau) nu s-au dovedit a fi capabile să prezică în mod fiabil cine va evolua spre demență (4, 7), indicând mai multe. este necesar să se includă instrumente holistice de biomarkeri bazate pe multiple aspecte ale fiziologiei creierului pentru a stratifica cu exactitate riscul acestei populații. Prin urmare, am analizat ulterior panoul nostru de biomarkeri validați cu AD în populația AsymAD din copia 1 a LCR. Aceste 31 de cazuri AsymAD au prezentat niveluri anormale de biomarker de bază (raportul ELISA Aβ1–42/tau total, <5,5) și cogniție completă (MoCA medie, 27,1). ± 2,2) (Tabelul S1A). În plus, toți indivizii cu AsymAD au un scor de demență clinic de 0, ceea ce indică faptul că nu există dovezi ale unei scăderi a performanței cognitive sau funcționale zilnice.
Am analizat mai întâi nivelurile panourilor validate în toate cele 96 de replici CSF 1, inclusiv cohorta AsymAD. Am descoperit că mai multe panouri din grupul AsymAD au avut modificări semnificative de abundență asemănătoare AD, panoul vascular a arătat o tendință descendentă în AsymAD, în timp ce toate celelalte panouri au arătat o tendință ascendentă (Figura 6A). Prin urmare, toate panourile au arătat o corelație foarte semnificativă cu ELISA Ap1-42 și nivelurile totale de tau (Figura 6B). În schimb, corelația dintre grup și scorul MoCA este relativ slabă. Una dintre cele mai izbitoare constatări din aceste analize este gama largă de abundențe de panouri din cohorta AsymAD. După cum se arată în Figura 6A, nivelul panoului al grupului AsymAD traversează de obicei nivelul panoului al grupului de control și al grupului AD, prezentând o variabilitate relativ mare. Pentru a explora în continuare această eterogenitate a AsymAD, am aplicat analiza Multidimensional Scaling (MDS) la 96 de cazuri de replicare a LCR 1. Analiza MDS permite vizualizarea similitudinii dintre cazuri pe baza anumitor variabile din setul de date. Pentru această analiză de grup, folosim doar acei markeri de panou validați care au o schimbare semnificativă statistic (P <0,05, AD/control) în nivelul de descoperire și replicare a CSF 1 proteom (n = 29) (Tabel S2L). Această analiză a produs o grupare spațială clară între cazurile noastre de control și AD (Figura 6C). În schimb, unele cazuri AsymAD sunt în mod clar grupate în grupul de control, în timp ce altele sunt localizate în cazurile AD. Pentru a explora în continuare această eterogenitate AsymAD, am folosit harta noastră MDS pentru a defini două grupuri de aceste cazuri AsymAD. Primul grup a inclus cazuri AsymAD grupate mai aproape de control (n = 19), în timp ce al doilea grup a fost caracterizat de cazuri AsymAD cu un profil de marker mai aproape de AD (n = 12).
(A) Nivelul de expresie (z-score) al grupului de biomarkeri CSF în toate cele 96 de probe din cohorta 1 de replicare a CSF, inclusiv AsymAD. Analiza varianței cu post-corecția lui Tukey a fost utilizată pentru a evalua semnificația statistică a modificărilor abundenței panoului. (B) Analiza corelației nivelului de abundență de proteine din panou (z-score) cu scorul MoCA și nivelul total de tau în probele ELISA Aβ1-42 și CSF copia 1. Este afișat coeficientul de corelație Pearson cu valoarea P relevantă. (C) MDS a 96 de cazuri CSF copie 1 s-a bazat pe nivelurile de abundență a 29 de markeri de panou validați, care au fost modificate semnificativ atât în setul de date de descoperire, cât și în CSF copie 1 [P <0,05 AD/control (CT)]. Această analiză a fost utilizată pentru a împărți grupul AsymAD în subgrupuri de control (n = 19) și AD (n = 12). (D) Graficul vulcanului arată expresia diferențială a tuturor proteinelor de replicare 1 a LCR cu modificarea de ori log2 (axa x) în raport cu valoarea P statistică -log10 între cele două subgrupuri AsymAD. Biomarkerii panoului sunt colorați. (E) Replicarea LCR Nivelul de abundență 1 al biomarkerilor grupului de selecție este exprimat diferențial între subgrupurile AsymAD. Analiza de varianță post-ajustată a lui Tukey a fost utilizată pentru a evalua semnificația statistică.
Am examinat expresia diferențială a proteinei dintre aceste cazuri de control și cazuri de AsymAD asemănătoare AD (Figura 6D și Tabelul S2L). Harta vulcanului rezultată arată că 14 markeri de panou s-au schimbat semnificativ între cele două grupuri. Majoritatea acestor markeri sunt membri ai sinapsei și metabolomului. Cu toate acestea, SOD1 și substratul protein kinazei C bogat în alanină miristoilată (MARCKS), care sunt membri ai grupurilor imune ale mielinei și, respectiv, gliale, aparțin de asemenea acestui grup (Figura 6, D și E). Panoul vascular a contribuit, de asemenea, cu doi markeri care s-au redus semnificativ în grupul AsymAD asemănător AD, inclusiv proteina de legare AE 1 (AEBP1) și membrul familiei complement C9. Nu a existat o diferență semnificativă între subgrupurile de control și ASymAD asemănătoare AD în ELISA AB1-42 (P = 0,38) și p-tau (P = 0,28), dar a existat într-adevăr o diferență semnificativă în nivelul total de tau (P = 0,0031). ) (Fig. S7). Există mai mulți markeri de panou care indică faptul că modificările dintre cele două subgrupuri AsymAD sunt mai semnificative decât nivelurile totale de tau (de exemplu, YWHAZ, SOD1 și MDH1) (Figura 6E). În general, aceste rezultate indică faptul că panoul nostru validat poate conține biomarkeri care pot subtipa și stratificarea potențială a riscului la pacienții cu boală asimptomatică.
Există o nevoie urgentă de instrumente de biomarkeri bazate pe sistem pentru a măsura și a viza mai bine diferitele patofiziologie din spatele AD. Se așteaptă că aceste instrumente nu doar să schimbe cadrul nostru de diagnosticare a AD, ci și să promoveze adoptarea de strategii de tratament eficiente, specifice pacientului (1, 2). În acest scop, am aplicat o abordare proteomică cuprinzătoare imparțială la creierul AD și LCR pentru a identifica biomarkeri LCR bazați pe web care reflectă o gamă largă de patofiziologie bazată pe creier. Analiza noastră a produs cinci panouri de biomarkeri LCR, care (i) reflectă sinapsele, vasele de sânge, mielina, disfuncția imună și metabolică; (ii) să demonstreze o reproductibilitate puternică pe diferite platforme MS; (iii) Arătați modificări progresive specifice bolii în stadiile incipiente și târzii ale AD. În general, aceste constatări reprezintă un pas promițător către dezvoltarea unor instrumente de biomarker diverse, fiabile, orientate pe web pentru cercetarea AD și aplicațiile clinice.
Rezultatele noastre demonstrează organizarea extrem de conservată a proteomului rețelei cerebrale AD și susțin utilizarea acestuia ca ancoră pentru dezvoltarea biomarkerilor pe bază de sistem. Analiza noastră arată că două seturi de date TMT-MS independente care conțin creiere AD și AsymAD au o modularitate puternică. Aceste descoperiri extind munca noastră anterioară, demonstrând conservarea modulelor puternice a mai mult de 2.000 de țesuturi cerebrale din mai multe cohorte independente în cortexul frontal, parietal și temporal (17). Această rețea de consens reflectă diferite modificări legate de boală observate în cercetările curente, inclusiv creșterea modulelor inflamatorii bogate în gliale și scăderea modulelor bogate în neuroni. Ca și cercetarea actuală, această rețea la scară largă prezintă, de asemenea, modificări modulare semnificative în AsymAD, arătând o varietate de fiziopatologie preclinice diferite (17).
Cu toate acestea, în acest cadru extrem de conservator bazat pe sistem, există o eterogenitate biologică mai fină, în special în rândul indivizilor aflați în stadiile incipiente ale AD. Panoul nostru de biomarkeri este capabil să descrie două subgrupuri în AsymAD, care demonstrează expresia diferențială semnificativă a mai multor markeri CSF. Grupul nostru a reușit să evidențieze diferențele biologice dintre aceste două subgrupuri, care nu au fost evidente la nivelul biomarkerilor de bază AD. Comparativ cu grupul de control, rapoartele Ap1-42/tau total ale acestor indivizi AsymAD au fost anormal de scăzute. Cu toate acestea, doar nivelurile totale de tau au fost semnificativ diferite între cele două subgrupuri AsymAD, în timp ce nivelurile de Aβ1-42 și p-tau au rămas relativ comparabile. Deoarece tau ridicat de LCR pare a fi un predictor mai bun al simptomelor cognitive decât nivelurile Aβ1-42 (7), bănuim că cele două cohorte AsymAD pot avea riscuri diferite de progresie a bolii. Având în vedere dimensiunea limitată a eșantionului nostru AsymAD și lipsa datelor longitudinale, sunt necesare cercetări suplimentare pentru a trage cu încredere aceste concluzii. Cu toate acestea, aceste rezultate indică faptul că un panou de LCR bazat pe sistem poate îmbunătăți capacitatea noastră de a stratifica în mod eficient indivizii în timpul stadiului asimptomatic al bolii.
În general, descoperirile noastre susțin rolul funcțiilor biologice multiple în patogeneza AD. Cu toate acestea, metabolismul energetic dereglat a devenit tema proeminentă a tuturor celor cinci panouri de etichetare validate. Proteinele metabolice, cum ar fi hipoxantin-guanin fosforibosiltransferaza 1 (HPRT1) și lactat dehidrogenaza A (LDHA), sunt cei mai puternic validați biomarkeri sinaptici, ceea ce indică faptul că creșterea AD LCR este sexul foarte reproductibil. Vasele noastre de sânge și panourile gliale conțin și câțiva markeri implicați în metabolismul substanțelor oxidative. Aceste descoperiri sunt în concordanță cu rolul cheie pe care procesele metabolice îl joacă în întregul creier, nu numai pentru a satisface cererea mare de energie a neuronilor, ci și pentru a satisface cererea mare de energie a astrocitelor și a altor celule gliale (17, 48). Rezultatele noastre susțin dovezi tot mai mari că modificările potențialului redox și întreruperea căilor energetice pot fi legătura de bază între câteva procese cheie implicate în patogeneza AD, inclusiv tulburările mitocondriale, inflamația mediată de glial și afectarea vasculară (49). În plus, biomarkerii metabolici ai lichidului cefalorahidian conțin un număr mare de proteine bogate diferențiat între subgrupurile noastre de control și ASymAD asemănătoare AD, ceea ce sugerează că întreruperea acestor căi de energie și redox poate fi critică în stadiul preclinic al bolii.
Diferitele tendințe ale panourilor de creier și lichid cefalorahidian pe care le-am observat au, de asemenea, implicații biologice interesante. Sinapsele și metabolomii bogati în neuroni arată niveluri scăzute în creierul AD și abundență crescută în lichidul cefalorahidian. Având în vedere că neuronii sunt bogați în mitocondrii producătoare de energie la sinapse pentru a furniza energie pentru numeroasele lor semnale specializate (50), este de așteptat similaritatea profilurilor de expresie ale acestor două grupuri de neuroni. Pierderea neuronilor și extrudarea celulelor deteriorate pot explica aceste tendințe ale panoului de creier și LCR în bolile ulterioare, dar nu pot explica schimbările timpurii ale panoului pe care le observăm (13). O posibilă explicație pentru aceste constatări în boala asimptomatică precoce este tăierea sinaptică anormală. Noi dovezi în modelele de șoarece sugerează că fagocitoza sinaptică mediată de microglia poate fi activată anormal în AD și poate duce la pierderea precoce a sinapselor la nivelul creierului (51). Acest material sinaptic aruncat se poate acumula în LCR, motiv pentru care observăm creșterea LCR în panoul neuronal. Tăierea sinaptică mediată imun poate explica, de asemenea, parțial creșterea proteinelor gliale pe care le observăm în creier și lichidul cefalorahidian pe parcursul procesului bolii. Pe lângă tăierea sinaptică, anomaliile generale ale căii exocitare pot duce, de asemenea, la expresii diferite ale markerilor neuronali din creier și LCR. O serie de studii au arătat că conținutul de exozomi din patogeneza creierului AD sa schimbat (52). Calea extracelulară este, de asemenea, implicată în proliferarea Ap (53, 54). Este demn de remarcat faptul că suprimarea secreției exosomale poate reduce patologia asemănătoare AD în modelele de șoareci transgenici AD (55).
În același timp, proteina din panoul vascular a arătat o creștere moderată a creierului AD, dar a scăzut semnificativ în LCR. Disfuncția barierei hematoencefalice (BBB) poate explica parțial aceste constatări. Multe studii independente post-mortem pe oameni au demonstrat defalcarea BBB în AD (56, 57). Aceste studii au confirmat diferite activități anormale care înconjoară acest strat etanș de celule endoteliale, inclusiv scurgerile capilare ale creierului și acumularea perivasculară de proteine suportate prin sânge (57). Acest lucru poate oferi o explicație simplă pentru proteinele vasculare crescute din creier, dar nu poate explica pe deplin epuizarea acestor aceleași proteine în lichidul cefalorahidian. O posibilitate este ca sistemul nervos central să izoleze în mod activ aceste molecule pentru a rezolva problema inflamației crescute și a stresului oxidativ. Reducerea unora dintre cele mai severe proteine din LCR din acest panou, în special a celor implicate în reglarea lipoproteinelor, este legată de inhibarea nivelurilor dăunătoare de inflamație și de procesul neuroprotector al speciilor reactive de oxigen. Acest lucru este valabil pentru Paroxonaza 1 (PON1), o enzimă care leagă lipoproteinele responsabilă de reducerea nivelurilor de stres oxidativ din circulație (58, 59). Precursorul alfa-1-microglobulinei/bikuninei (AMBP) este un alt marker reglat în mod semnificativ în jos al grupului vascular. Este precursorul transportorului lipidic bikunin, care este, de asemenea, implicat în suprimarea inflamației și protecția neurologică (60, 61).
În ciuda diferitelor ipoteze interesante, incapacitatea de a detecta direct mecanismele bolii biochimice este o limitare bine-cunoscută a analizei proteomice bazate pe descoperire. Prin urmare, sunt necesare cercetări suplimentare pentru a defini cu încredere mecanismele din spatele acestor panouri de biomarkeri. Pentru a se îndrepta către dezvoltarea analizei clinice bazate pe MS, direcția viitoare necesită, de asemenea, utilizarea de metode cantitative țintite pentru verificarea biomarkerilor pe scară largă, cum ar fi monitorizarea selectivă sau paralelă a reacțiilor (62). Am folosit recent monitorizarea reacțiilor paralele (63) pentru a valida multe dintre modificările proteinei LCR descrise aici. Mai multe obiective prioritare ale panoului sunt cuantificate cu o acuratețe semnificativă, inclusiv YWHAZ, ALDOA și SMOC1, care se mapează la panourile noastre de sinapse, metabolism și, respectiv, inflamație (63). Achiziția independentă de date (DIA) și alte strategii bazate pe MS pot fi, de asemenea, utile pentru verificarea țintei. Bud și colab. (64) Sa demonstrat recent că există o suprapunere semnificativă între biomarkerii AD identificați în setul nostru de date de descoperire a LCR și setul de date independent DIA-MS, care constă din aproape 200 de mostre de LCR din trei cohorte europene diferite. Aceste studii recente susțin potențialul panourilor noastre de a se transforma într-o detectare fiabilă bazată pe MS. Detectarea tradițională pe bază de anticorpi și aptameri este, de asemenea, importantă pentru dezvoltarea ulterioară a biomarkerilor cheie AD. Datorită abundenței scăzute de LCR, este mai dificil să se detecteze acești biomarkeri folosind metode MS cu randament ridicat. NEFL și NRGN sunt două astfel de exemple de biomarkeri CSF cu abundență scăzută, care sunt mapați la panoul în analiza noastră cuprinzătoare, dar nu pot fi detectați în mod fiabil folosind strategia noastră unică de MS. Strategiile de direcționare bazate pe anticorpi multipli, cum ar fi PEA, pot promova transformarea clinică a acestor markeri.
În general, acest studiu oferă o abordare proteomică unică pentru identificarea și verificarea biomarkerilor AD LCR pe baza diferitelor sisteme. Optimizarea acestor panouri de markeri în cohorte suplimentare de AD și platforme MS se poate dovedi promițătoare pentru a avansa stratificarea și tratamentul riscului AD. Studiile care evaluează nivelul longitudinal al acestor panouri în timp sunt, de asemenea, esențiale pentru a determina ce combinație de markeri stratifică cel mai bine riscul de boală precoce și modificări ale severității bolii.
Cu excepția celor 3 eșantioane copiate de CSF, toate probele de LCR utilizate în acest studiu au fost colectate sub auspiciile Emory ADRC sau instituții de cercetare strâns legate. Un total de patru seturi de probe Emory CSF au fost utilizate în aceste studii de proteomică. S-a descoperit că cohorta CSF conține mostre de la 20 de martori sănătoși și 20 de pacienți cu AD. Copia 1 de CSF include mostre de la 32 de controale sănătoase, 31 de indivizi AsymAD și 33 de indivizi AD. Copia 2 de LCR conține 147 de controale și 150 de probe AD. Cohorta 4 de replicare a LCR cu mai multe boli a inclus 18 probe de control, 17 AD, 19 ALS, 13 PD și 11 probe FTD. Conform acordului aprobat de Consiliul de revizuire instituțional al Universității Emory, toți participanții la studiu Emory au obținut consimțământul informat. Conform Ghidurilor pentru cele mai bune practici ale Institutului Național de Îmbătrânire din 2014 pentru Centrele Alzheimer (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), lichidul cefalorahidian a fost colectat și stocat prin puncție lombară. Pacienții de control și AsymAD și AD au primit evaluare cognitivă standardizată la Clinica de Neurologie Cognitivă Emory sau ADRC Goizueta. Probele lor de lichid cefalorahidian au fost testate de INNO-BIA AlzBio3 Luminex pentru ELISA Aβ1-42, analiza tau total și p-tau (65). Valorile ELISA sunt utilizate pentru a susține clasificarea diagnostică a subiecților pe baza criteriilor de limitare a biomarkerilor AD stabilite (66, 67). Datele demografice și de diagnostic de bază pentru alte diagnostice de LCR (FTD, ALS și PD) sunt, de asemenea, obținute de la Emory ADRC sau de la instituțiile de cercetare afiliate. Metadatele rezumate ale cazurilor pentru aceste cazuri Emory CSF pot fi găsite în Tabelul S1A. Caracteristicile cohortei 3 de replicare a LCR elvețian au fost publicate anterior (45).
CSF a găsit proba. Pentru a crește profunzimea descoperirii noastre a setului de date CSF, consumul imun de proteine cu abundență mare a fost efectuat înainte de tripsinizare. Pe scurt, 130 μl de LCR din 40 de probe individuale de LCR și un volum egal (130 μl) de rășină High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) au fost plasate într-o coloană de centrifugare (Thermo Fisher Scientific, A89868) în cameră. temperatura Incubare). După centrifugare timp de 15 minute, centrifugă proba la 1000 g timp de 2 minute. Un dispozitiv de filtru ultracentrifugal 3K (Millipore, UFC500396) a fost utilizat pentru a concentra proba de efluent prin centrifugare la 14.000 g timp de 30 de minute. Se diluează toate volumele de probă la 75 μl cu soluție salină tamponată cu fosfat. Concentrația proteinei a fost evaluată prin metoda acidului bicinchoninic (BCA) conform protocolului producătorului (Thermo Fisher Scientific). LCR imunodeplecat (60 μl) din toate cele 40 de probe a fost digerat cu lisil endopeptidază (LysC) și tripsină. Pe scurt, proba a fost redusă și alchilată cu 1,2 μl 0,5 M tris-2(-carboxietil)-fosfină și 3 μl 0,8 M cloracetamidă la 90°C timp de 10 minute și apoi sonicat într-o baie de apă timp de 15 minute. Proba a fost diluată cu 193 μl tampon uree 8 M [uree 8 M și NaHPO4 100 mM (pH 8,5)] până la o concentrație finală de uree 6 M. LysC (4,5 μg; Wako) este utilizat pentru digestia peste noapte la temperatura camerei. Proba a fost apoi diluată la 1 M uree cu 50 mM bicarbonat de amoniu (ABC) (68). Se adaugă o cantitate egală (4,5 μg) de tripsină (Promega) și apoi se incubează proba timp de 12 ore. Acidificați soluția de peptidă digerată la o concentrație finală de 1% acid formic (FA) și 0,1% acid trifluoracetic (TFA) (66), apoi desarate cu o coloană Sep-Pak C18 de 50 mg (Waters), așa cum este descris mai sus (25) . Peptida a fost apoi eluată în 1 ml de acetonitril 50% (ACN). Pentru a standardiza cuantificarea proteinelor în loturi (25), alicote de 100 μl din toate cele 40 de probe de LCR au fost combinate pentru a genera o probă mixtă, care a fost apoi împărțită în cinci probe standard interne globale (GIS) (48). Toate probele individuale și standardele combinate sunt uscate prin vid de mare viteză (Labconco).
CSF copiază proba. Dayon și colegii au descris anterior epuizarea imunității și digestia probelor din copia 3 de LCR (45, 46). Probele replicate rămase nu au fost imunodeplecate individual. Digerați aceste probe neînlăturate în tripsină așa cum s-a descris anterior (17). Pentru fiecare analiză repetată, 120 μl alicote de peptidă eluată din fiecare probă au fost reunite împreună și împărțite în alicote de volum egal pentru a fi utilizate ca standard intern global marcat cu TMT (48). Toate probele individuale și standardele combinate sunt uscate prin vid de mare viteză (Labconco). Pentru a îmbunătăți semnalul proteinei LCR cu abundență scăzută, prin combinarea a 125 μl din fiecare probă, a fost pregătită o probă „îmbunătățită” pentru fiecare analiză replicată [adică, o probă biologică care imită proba de cercetare, dar cantitatea disponibilă este mult mai mare (37, 69)] fuzionat într-o probă mixtă de LCR (17). Proba amestecată a fost apoi imuno îndepărtată folosind 12 ml de rășină High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), digerată așa cum este descris mai sus și inclusă în etichetarea TMT multiplă ulterioară.
Ora postării: 27-aug-2021